Úloha č. 4


                       Stanovení koncentrace IgA v lidském séru metodou RID

              (precipitační reakce - jednoduchá radiální imunodifúze dle Manciniové)


Teorie:

   Kvantitativní zjištění hladiny mnohých antigenů je možno provést pomocí jednoduché radiální
imunodifuze (metodika podle Manciniové). Principem je difuze antigenu z jedné jamky gelem
s konstantním obsahem rozpuštěné protilátky. Po ustálení rovnovážného stavu dochází v místě
ideálního poměru mezi antigenem a protilátkou ke vzniku precipitační linie tvaru prstence okolo
centrální jamky.

   Pomocí RID je možno stanovit koncentrace mnohých bílkovinných součástí séra - metodika se dříve
používala při měření hladin celkového IgG, IgA, IgM, složek komplementu nebo různých proteinů
akutní fáze. Většina těchto vyšetření je však v dnešní době automatizována a provádí se na principu
nefelometrie. V naší laboratoři metodou RID ale stále měříme koncentrace C2, C5 složek komplementu
a revmatoidní faktor.


Provedení:


  * Navážit 0,048 g agarózy, přidat 4 ml PBS (pro gel velikosti podložního sklíčka 7,5 x 2,5 cm) a
rozvařit cca 30 min.
  * Zchladit ve vodní lázni o teplotě 50 ^oC po dobu 10 min.


  * K vytemperovanému roztoku agarózy přidat vytemperovaných 265 ml antiséra anti-IgA (také na 50
^oC), dobře promíchat a rozlít na skleněnou desku.
  * Nechat ztuhnout, pak dát do lednice cca na 1 hodinu.


  * Naředit standardní vzorek roztokem PBS na jednotlivé koncentrace – viz schéma:













  * Naředit vyšetřovaná séra 1:2 roztokem PBS, např.: 20 ml PBS + 20 ml séra.


  * Vykrojit v agaróze pomocí jehly jamky podle šablony.


  * Do jamek napipetovat 5 ml jednotlivých ředění standardního vzorku a vyšetřovaných sér – viz
schéma:











  * Inkubace ve vlhké komůrce při laboratorní teplotě 48 hodin.


  * Odečíst velikost precipitačních prstenců pomocí speciálního pravítka SEVAC a interpolací
z kalibrační křivky (přímky) vypočítat koncentrace IgA ve vyšetřovaných vzorcích.


Výsledek:

   Druhá mocnina průměru precipitačního kruhu (pravítkem SEVAC odečítám rovnou tuto hodnotu) je
přímo úměrná koncentraci antigenu.


Ref. rozmezí   nad 13 roků:     0,82 g/l – 4,53 g/l