Přirozené protilátky (PP)


  * Do činnosti imunitního systému se zapojují nejen protilátky vznikající známým antigenním
podnětem, ale také přirozené protilátky neimunizovaných jedinců.


  * Jsou nazývány přirozené, protože Landsteiner již začátkem století u jedinců, kteří mají krevní
skupinu A, prokázal vznik anti-B-aglutininů přirozenými mechanismy.


  * tvoří se spontánně, bez záměrné imunizace


  * jsou polyreaktivní s nízkou aviditou


  * většina patří do isotypu IgM (IgM také nejvíce aglutinuje, je to pentamer)


  * Normální sérum zdravých jedinců obsahuje přirozené protilátky IgM, IgG a IgA.


  * jejich fyziologický význam se předpokládá:


-          v časných stádiích infekčních procesů

-          při regulaci rozvoje autoimunitních chorob

-          též při odstraňování stárnoucích, fyziologicky degradovaných molekul a buněk


  * Patří mezi ně protilátky proti krevním skupinám – IZOHEMAGLUTININY, které jsou vytvářeny
postnatálně po antigenních stimulech fyziologické mikroflóry.


·         Významnou součástí repertoáru přirozených protilátek jsou xenoaglutininy, prokazované
aglutinací s králičími erytrocyty.


·         Pozoruhodná role byla přirozeným protilátkám připsána při zavádění xenotransplantátu
(prase – člověk), protože xenoaglutininy jsou mj. příčinou odvrhávání xenotransplantátu.












                                            Úloha č. 2


                       Stanovení titru přirozených protilátek v lidském séru

                                    (metoda: přímá aglutinace)


Teorie:

   Z plné krve jedince se získává sérum, ve kterém můžeme stanovit výšky hladin různých látek
charakterizujících nám současný zdravotní stav jedince (v imunologii jsou to např. stanovení
imunoglobulinů, proteinů akutní fáze, složek komplementu, autoprotilátek proti vlasním tkáním,
protilátek proti mikroorganismům, atd.).

   Přirozené protilátky se v laboratoři našeho ústavu prokazují od 70. let minulého století
aglutinací s králičími erytrocyty, a toto stanovení nám slouží ke screeningu diagnózy
agamaglobulinémie.

Králičí erytrocyty, stejně jako endoteliální buňky mnoha zvířat, ale NE lidí ani vyšších primátů,
mají na svém povrchu epitopy, proti kterým jsou lidské xenoaglutininy namířeny.


Provedení:


  * ve vyšetřovaném séru je třeba inaktivovat komplement (vodní lázeň…56 ^oC…30 min.)


  * sérum každého pacienta se následně naředí dvojkovou řadou – viz schéma:













  * králičí erytrocyty uchovávané při 4 ^oC v Alseverově roztoku se 3x promyjí fyziologickým
roztokem; po každém promytí centrifugace vždy 2000 rpm 10 min.


  * z promytých králičích erytrocytů se připraví 0,5 % suspenze (ery + fyziol. roztok), která se
přidá do každé zkumavky  – viz schéma:










  * v každém prováděném testu je vždy potřeba mít i jednu zkumavku s negativní kontrolou (200 ml
fyziol. roztoku + 200 ml suspenze král. ery)


  * všechny zkumavky se nechají inkubovat 2 h při 37 ^oC v termostatu, a pak přes noc při 4 ^oC v
ledničce


  * druhý den se okometricky odečítá hemaglutinace po důkladném protřepání zkumavek


Výsledek:

   U každého pacienta se určuje titr protilátek, neboli největší zředění séra, při kterém je
aglutinace erytrocytů ještě prokazatelná.

Čím je stanovený titr větší, tím je i vyšší koncentrace přirozených protilátek v daném séru.


Ref. rozmezí:   1:32 – 1:256



                                            Úloha č. 3


                 Latex-fixační test pro zjištění přítomnosti revmatoidního faktoru

                                   (metoda: nepřímá aglutinace)


Teorie:

   Latexové částice nesou na svém povrchu (jsou potaženy) lidský g globulin. Revmatoidní faktor
(RF) je autoprotilátka namíření proti Fc části IgG molekuly, přítomná asi u 80% pacientů
s revmatoidní artritidou, pozitivní je též u asi 5 – 10 % nemocných s jinými systémovými
autoimunitními chorobami, autoimunitní hepatitidy, endocarditis lenta. Může být pozitivní i u
zdravých osob. Diagnosticky nejdůležitější je RF ve třídě IgM.

   Citlivost této reakce je vyšší než 1 IU/ml RF.


Provedení:


  * testované sérum se zředí 1:20, tj. 20 ml séra + 380 ml glycinového pufru


  * na černé testovací sklíčko se dá vedle sebe 50 ml naředěného séra (nebo pozitivní, a nebo
negativní kontroly) a 1 kapka dobře promýchaného latexového reagentu


  * obě kapky se smíchají dohromady a rozprostřou k okraji vymezené testovací plochy


  * opatrným nakláněním sklíčka do stran se pak vzorky promíchávají a po 2 minutách můžeme
pozorovat pod přímým světlem makroskopickou aglutinaci


Výsledky:

   U pozitivní reakce je viditelná aglutinace latexových partikulí, a odlišuje se od jemných
granulí mléčného pozadí (negativní kontroly).

   Tímto testem můžeme určovat RF i semikvantitativně. Stejně jako v úloze č. 2 je možné sérum
naředit geometrickou řadou a určit titr séra, který ještě aglutinuje latexové částice.