Úloha č. 7

                                     NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE


Teorie:

Imunofluorescence je metoda založená na vizualizaci reakce antigen-protilátka protilátkou označenou
fluorescenční barvičkou. Je považována za zlatý standard pro stanovení autoprotilátek. Nejčastěji
používanými substráty jsou: buněčná linie Hep2 (buňky nazofaryneálního karcinomu), prvok Critidium
lucilliae, lidské neutrofilní leukocyty, řez opičího jícnu, krysí ledviny+krysí žaludek+játra.
Nejčastěji používaným fluorochromem je FITC (fluoresceinizothiokyanát) jež při vlnové délce 490 nm
emituje charakteristické zelené světlo.


Provedení:

1.      PŘÍPRAVA VYŠETŘOVANÝCH VZORKŮ

-          sérum (zamražené sérum pacienta) naředit v PBS 1:81 (10μl séra  800 μl PBS)


2.      PŘÍPRAVA SKEL

-          skla nechat vytemperovat


3.      APLIKACE VZORKŮ

-          napipetovat na řez 25 μl naředěného séra na pomocný nosič (každé okénko)


4.      INKUBACE

-          Překlopit na nosič sklíčko s buňkami 30 min při laboratorní teplotě


5.      PŘÍPRAVA KONJUGÁTU

-          USOL - k lyofilizovanému konjugátu přidat destilovanou vodu dle návodu výrobce (1 nebo 2
ml)

-          nechat dobře rozpustit

-          1 ml z ampulky + 8 ml PBS + 0,250ml ředěné Evans Blue (lze připravit i poloviční dávku)


6.      OPLACH

-          skla spláchnout proudem PBS, nechat prát v PBS 5 min

-          opatrně otřít zadní stranu a hrany skla


7.      APLIKACE KONJUGÁTU

-          aplikovat 20 μl naředěného konjugátu


8.      INKUBACE

-          30 min při laboratorní teplotě ve vlhké komůrce


9.      OPLACH

-          skla spláchnout proudem PBS, nechat prát v PBS 5 min

-          opatrně otřít zadní stranu a hrany skla


10.  FIXACE

-          na jednotlivé okénka nakapat malé kapičky glycerinu

-          opatrně přiložit reakční sklíčko


11.  ODEČÍTÁNÍ

-          fluorescenční mikroskop při zvětšení 40x