Úloha č. 7


                            Funkční vyšetření komplementového systému:

                          TEST CH50 pro spuštění kaskády klasickou cestou

Teorie:

            Komplement řadíme mezi humorální složky nespecifické imunity odstraňující patogeny
z organismu. Je tvořen souborem asi 30 sérových a membránových termolabilních proteinů, které za
normálních okolností kolují v těle ve formě inaktivních proenzymů. Pokud dojde ke spuštění kaskád
dojde k postupné amplifikaci imunitní odpovědi/komplementové kaskády a tvorbě lytického komplexu
(MAC-komplex). Nejdůležitějšími složkami komplementu jsou sérové složky C1 – C9, které jsou
syntetizovány převážně hepatocyty v játrech. Komplementový systém je aktivován třemi způsoby:
alternativní, klasickou či lektinovou cestou. Hlavními funkcemi komplementových složek jsou: lýza
buněk, opsonizace a chemotaxe.

            Test CH50 je funkčním testem komplementového systému spuštěného klasickou cestou
aktivace (tzn. cestou, na jejímž počátku je vazba protilátky na antigen povrchu např. cizorodé
bakterie→vazba proteinu C1→štěpení C2 a C4→vytvoření C3-konvertázy (C4bC2a) →vytvoření
C5-konvertázy (C4bC2aC3b) C4bC2a→tvorba lytického komplexu). Cílem tohoto testu je stanovit
množství séra obsahujícího složky komplementu, které způsobí  50%tní hemolýzu definovaného množství
beraních červených krvinek senzibilizovaných kraličími protilátkami. Stupeň hemolýzy je stanovován
spektrofotometricky na základě množství uvolněného hemoglobinu z lyzovaných krvinek.


Principielní postup:

Ø  navázání králičích protilátek (amboceptor) na povrch beraních krvinek

Ø  přidání vyšetřovaného séra v různých koncentracích (1:40-1:320) se složkami komplementu

Ø  lýza krvinek→ uvolnění hemoglobinu→měření absorbance


Provedení:
 1. Příprava beraních erytrocytů:beraní erytrocyty třikrát propereme ve fyziologickém roztoku
(10min/2000ot.). Naředíme 0,75 ml promytých erytrocytů 9,5ml fyziologického roztoku (fyz.roz.).
 2. 0,25 ml z naředěných krvinek nechat zlyzovat s 3,5 ml  Na[2]CO[3], odebrat 1ml do kyvety a
změřit absorbanci na spektrofotometru. Našim cílem je vytvoření 5% směsi krvinek. Její absorbance
je A[541]=0,700. Dle výsledku spektrofotometrického měření předběžně naředěné směsi tuto doředíme
dle potřeby. Takto připravené krvinky je možno skladovat až do jejich použití v lednici.
 3. Příprava amboceptoru (králičích protilátek): amboceptor ředíme 1:1000 s fyziologickým roztokem
(tzn. 10ul protilátek + 10 ml fyz.roz.). Takto připravený naředěný amboceptor je možno skladovat až
do jeho použití v lednici.
 4. Vytvoření hemolytického systému: 10ml naředěných erytrocytů + 10 ml amboceptoru (VŽDY PŘIDÁVAT
AMBOCEPTOR DO ERYTROCYTŮ) – inkubace 15-30min.
 5. Příprava sér: Sérum, které bylo do hodiny od odběru zamraženo (složky komplementu jsou
termolabilní!) je nutno rozmrazit na pokojovou teplotu a před pipetováním důkladně promíchat.

Mícháme dvojí výchozí ředění:             1:40 → 15ul séra + 585ul fyz.roz.

                                                                 1:60 → 10ul séra + 590ul fyz.roz.


 6. Příprava mikrotitrační destičky: Každý pacient se zpracovává v dubletu – dvě řady. Do jamek
v řadách B,C,D a F,G si předpipetujeme 100ul fyz.roz.(krok 1)). Dále napipetujeme séra ve dvojím
ředění dle schématu (krok 2))– sérum 1:40 100ul do jamek mikrotitrační destičky v řadě A a B, 1:60
100ul do jamek v řadě E a F. V jamce B směs pipetou promícháme a přenesena 100ul do jamky C, zde
opět promícháme pipetou a přeneseme do jamky D, zde směs promícháme a odstraníme 100ul do odpadu.
Stejně tak v jamce F směs promícháme a přeneseme do jamky G, kde směs promícháme pipetou a 100ul
odstraníme do odpadu. Do první jamky v řadě H napipetujeme 100ul fyziologického roztoku (0% lýza)
do druhé jamky v dubletu v řadě H napipetujeme 100ul H[2]O (100% lýza).

Do všech jamek napipetujeme 100ul hemolytického systému (krok 3)).



 7. Inkubace 60 min v termostatu při 37°C.
 8. Centrifugace destičky 5 min při 2000 otáček/min.
 9. Po centrifugaci přepipetovat 100ul z každé jamky do nepoužitých jamek mikrotitrační destičky
při zachování pořadí a umístění jamek.
10. Změřit na readeru pro mikrotitrační destičky při 541 nm.
11. Výsledky jamek v dubletu vždy zprůměrovat kromě jamek v řadě H. Seřadit dle stoupající
koncentrace séra v jamce – tzn.dle stoupající hemolýzy (čím větší ředění, tím méně séra).