SEPARACE LYMFOCYTŮ PERIFERNÍ KRVE

                       Separace lymfocytů na základě jejich vznášivé hustoty



Provedení:


1.                 Pro dvojici: dva odběry 2,7 ml heparinizované/EDTA krve.

2.                 Krev přelít do kontejnerku s 5 ml RPMI-1640.

3.                 Vrstvení pro izolaci lymfocytů probíhá do zkumavky  s připravenými 3,5 ml
Lymphoprepu (separační médium o hustotě 1,077g/ml).

4.                 Na toto separační médium opatrně navrstvit pasterkou asi 5 ml ředěné krve (krev
+ RPMI) – VRSTVY SE NESMÍ PROMÍCHAT!!! (1 kontejnerek=2 studenti)

5.                 Centrifugace 2500 ot./30 min.

6.                 Po ukončení centrifugace odstraníme do odpadu pasterkou horní vrstvu (krevní
plazma).

7.                 Poté odebereme opatrně pasterkou prstenec lymfocytů (rozhraní mezi krevní
plazmou a separační tekutinou).

8.                 Do zkumavky přidáme 2-3ml RPMI (pasterka) a promícháme pasterkou, aby se směs
dobře promíchala.

9.                 Centrifugujeme 1800 ot./10 min.

10.             Zkontrolujeme prstenec lymfocytů na dně zkumavky a slijeme.

11.             Do zkumavky napipetujeme 1 ml RPMI, dobře rozmícháme pipetou a přeneseme do čisté
zkumavky.

12.             Změříme na přístroji k počítání leukocytů – naměřená hodnota na displeji udává
počet leukocytů *10^6 v 1 ml.

                                 SEPARACE LYMFOCYTŮ PERIFERNÍ KRVE

                       Separace lymfocytů na základě jejich vznášivé hustoty



Provedení:


1.     Pro dvojici: dva odběry 2,7 ml heparinizované/EDTA krve.

2.     Krev přelít do kontejnerku s 5 ml RPMI-1640.

3.     Vrstvení pro izolaci lymfocytů probíhá do zkumavky  s připravenými 3,5 ml Lymphoprepu
(separační médium o hustotě 1,077g/ml).

4.     Na toto separační médium opatrně navrstvit pasterkou asi 5 ml ředěné krve (krev + RPMI) –
VRSTVY SE NESMÍ PROMÍCHAT!!! (1 kontejnerek=2 studenti)

5.     Centrifugace 2500 ot./30 min.

6.     Po ukončení centrifugace odstraníme do odpadu pasterkou horní vrstvu (krevní plazma).

7.     Poté odebereme opatrně pasterkou prstenec lymfocytů (rozhraní mezi krevní plazmou a
separační tekutinou).

8.     Do zkumavky přidáme 2-3ml RPMI (pasterka) a promícháme pasterkou, aby se směs dobře
promíchala.

9.     Centrifugujeme 1800 ot./10 min.

10. Zkontrolujeme prstenec lymfocytů na dně zkumavky a slijeme.

11. Do zkumavky napipetujeme 1 ml RPMI, dobře rozmícháme pipetou a přeneseme do čisté zkumavky.

12. Změříme na přístroji k počítání leukocytů – naměřená hodnota na displeji udává počet leukocytů
*10^6 v 1 ml.