Katedra laboratorních metod Bakalářské studium – zdravotní laborant LF MU Klinická biochemie – cvičení Praktické cvičení č.4 datum:............................ jméno:.......................................................... Téma: Carryover (zavlečená chyba měření) - příklad stanovení Přístroje a pomůcky: Automatický analyzátor cobas 6000 (Roche) Diagnostická souprava GLUC2 (stanovení s hexokinázou, Roche) Standardní roztok glukózy Stojánky, zkumavky, mikropipety, dávkovače, špičky, odměrné baňky, Úkoly: 1) Vypočítejte navážku glukózy na přípravu 500 ml standardního roztoku glukózy s koncentrací glukózy 200 mmol/l. Mr (glukóza.H[2]O) = 198,18 Navážka glukózy je: ......................... g 5,00 mmol/l roztok N 22,00 mmmol/l roztok V Objem standardního roztoku ................. ml Objem standardního roztoku ................. ml Objem destilované vody ................. ml Objem destilované vody ................. ml 2) Vypočítejte kolik ml standardního roztoku glukózy s koncentrací glukózy 200 mmol/l a kolik ml destilované vody je potřeba na přípravu dvou roztoků s koncentraci glukózy 5,00 mmol/l a 22,00 mmol/l (označené N a V), aby výsledný objem byl 100 ml. . 3) Pokud by měření probíhalop, 43 vzorků glukózy by se v pořadí dle následující tabulky změřilo v nepřetržité řadě na analyzátoru. Vzorek č. Vzorek glukózy Vzorek č. Vzorek glukózy Vzorek č. Vzorek glukózy Vzorek č. Vzorek glukózy 1 V 13 V 25 V 37 V 2 V 14 V 26 V 38 V 3 V 15 V 27 V 39 V 4 N 16 N 28 N 40 N 5 N 17 N 29 N 41 N 6 N 18 N 30 N 42 N 7 V 19 V 31 V 43 V 8 V 20 V 32 V 9 V 21 V 33 V 10 N 22 N 34 N 11 N 23 N 35 N 12 N 24 N 36 N 4) Uvažujme, že výsledky byly následující: Vzorek č. Glukóza (mmol/l) Vzorek č. Glukóza (mmol/l) Vzorek č. Glukóza (mmol/l) Vzorek č. Glukóza (mmol/l) 1 21,8 13 22,0 25 21,8 37 21,9 2 21,9 14 21,9 26 21,9 38 22,0 3 21,8 15 21,9 27 21,9 39 21,8 4 5,0 16 5,0 28 5,0 40 4,8 5 4,9 17 4,8 29 4,9 41 4,9 6 5,0 18 4,9 30 4,9 42 4,9 7 21,8 19 21,8 31 22,0 43 22,0 8 21,9 20 21,9 32 21,9 9 21,9 21 21,9 33 22,0 10 4,9 22 4,9 34 5,0 11 4,9 23 4,9 35 4,9 12 5,0 24 4,9 36 5,0 5) Výsledky nyní uspořádejte do čtyř skupin označených A - B - C - D A B C D Vzorek č. Glukóza (mmol/l) Vzorek č. Glukóza (mmol/l) Vzorek č. Glukóza (mmol/l) Vzorek č. Glukóza (mmol/l) 3 7 6 4 9 13 12 10 15 19 18 16 21 25 24 22 27 31 30 28 33 37 36 34 39 43 42 40 6) Data uspořádejte pomocí počítačového programu Excel a statisticky vyhodnoťte a rozhodněte, zda se hodnoty ve sloupcích A a B liší. Stejným způsobem vyhodnoťte hodnoty ve sloupcích C a D. Postup: * Otevřete Excel * Nástroje - Analýza dat ( v případě, že tato položka není v nástrojích vidět vybrat Doplňky, zatrhnout Analytické nástroje, OK – pak se již Analýza dat v nástrojích objeví) * Vybereme: Dvouvýběrový t-test s rovností rozptylů - OK * Vstup 1.soubor: označíme hodnoty v prvním souboru (např. soubor A) - OK * Vstup 2.soubor: označíme hodnoty v druhém souboru (např. soubor B) - OK * Možnosti výstupu: Nový list nebo Výstupní oblast * Hodnoty vytisknout, vyhodnotit data Dvouvýběrový t-test s rovností rozptylů Soubor 1 Soubor 2 Střední hodnota (průměr) Rozptyl (s^2) Pozorování t stat t krit(2) Je vypočítaná hodnota (t stat) větší než hodnota tabelovaná (t krit(2))? ANO NE Pokud ANO: můžeme zamítnout nulovou hypotézu, máme 95% jistotu, že mezi souborem 1 a souborem 2 je významný rozdíl Rozdíl mezi soubory A a B: ...................... mmol/l Rozdíl mezi soubory C a D: ...................... mmol/l Závěr: Téma: Ověření některých vlastností analytické metody Úkol: 1. sledování průběhu reakce metody pro stanovení celkového bilirubinu 2. určení vhodných měřících bodů 3. vymezení horní hranice pracovního rozsahu metody 4. analýza vzorků s koncentrací analytu nad pracovní rozsah metody – rerun funkce analyzátoru Přístroje a pomůcky: Automatický analyzátor Cobas 6000 (Roche), zásobní standard bilirubinu o koncentraci 1566 umol/l, reagencie pro stanovení celkového bilirubinu T Bili (Roche Diagnostic), zkumavky, pipety, destilovaná voda Provedení: 1. sledování průběhu reakce metody použité pro stanovení bilirubinu · na analyzátoru prohlédněte průběh reakce stanovení bilirubinu o koncentraci cca 200 umol/l · z průběhu reakční závislosti určete o jaký typ reakce se jedná Závěr:_____________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________ 2. určení vhodných měřících bodů · na základě znalosti průběhu reakce určete body (čas) vhodné pro měření absorbance vzorku Závěr:_____________________________________________________________________________________________ _____________________________________ 3. vymezení horní hranice pracovního rozsahu metody * ze zásobního standardu bilirubinu koncentrace 1380 umol/l připravte ředěním destilovanou vodou řadu vzorků o koncentracích uvedených v tabulce 1 tak, aby výsledný objem naředěných vzorků byl kolem 200 ul. * vzorky dobře promíchejte a analyzujte za podmínek určených v bodě 2 * naměřené hodnoty koncentrací a jejich průměr zapište do tabulky 1 * sestrojte v Excelu graf závislosti koncentrací bilirubinu nalezených ve vzorcích neředěných i ředěných na teoretických koncentracích z tabulky 1 * ze znázorněné závislosti odhadněte horní hranici pracovního rozsahu analytické metody Tabulka 1 Číslo vzorku Koncentrace bilirubinu (umol/l) (teoretická) Objem zásobního standardu (ul) Objem destilované vody (ul) Konc. bilirubinu naměřené (umol/l) Konc. bilirubinu naměřené (umol/l) - Rerun 1 0 0 200 2 10 190 3 20 180 4 50 150 5 80 120 6 100 100 7 150 50 8 1380 200 0 Závěr:_____________________________________________________________________________________________ _____________________________________ Téma praktika: Interference (hemolýza, chylozita, bilirubin ) Přístroje a pomůcky: Automatický biochemický analyzátor Sérové vzorky (hemolytické, chylózní, ikterické) Úkoly: 1) Na větším počtu vzorků se seznamte s vizuální klasifikací hemolytických, chylózních a ikterických vzorků – např. slabá hemolýza hemolýza silná hemolýza 2) Seznámení s jinými typy interference: Léky – např. diuretika a kortikosteroidy zvyšují kreatinin, marihuana a vankomycin kreatinin naopak snižují estrogeny – zvyšují Cu v séru Gamapatie - ve vzácných případech při této diagnóze může být KM snížena, bilirubin zvýšen. Monoklonální iImunoglobuliny jsou u turbidimetrických metod pravidelně zvýšeny – nelze je správně stanovit jinak než elektroforeticky. Interference vzniklá nedodržením preanalytických podmínek – zvýšené parametry po podávání Fe, T4, infuzi, intenzivní fyzické aktivitě (CK). 3) V biochemickém analyzátoru vypište sérové indexy a zapište je (po krátkém seznámení s významem sérových indexů): L: H: I: 4) Interference mohou být jak pozitivní, tak negativní. Uveďte, zda budou výsledky zvýšené nebo snížené u následujících.parametrů: K, LD, Bil přímý, AST. Závěr: 5) Seznamte se s komentováním interference u vzorků pacientů v LIS, vložení komentáře si prakticky vyzkoušejte 6) Teoreticky se seznamte s možností vyčeření lipemického séra (mléčně zkaleného) s využitím zkumavky Lipoclear: Pracovní postup: 1. Zkumavku Lipoclear po vyjmutí z lednice necháme stát 5 min. při pokojové teplotě 2. Do zkumavky napipetujeme 1,5 ml séra, dobře promícháme 3. Necháme stát dalších 5 min. při pokojové teplotě 4. Zcentrifugujeme na centrifuze 2 min. při 10 000 ot. 5. Opatrně odstraníme tukovou vrstvu, která se vytvořila na povrchu 6. Všechny výsledky vynásobíme faktorem 1,2 ( jako kompenzace ředění originálního vzorku ) Vyčeřování se používá, obsahuje-li mléčně zkalené sérum některou z následujících metod: Mg, Ca, IgG, CB, Krea Vyčeřování se nepoužívá, ,je-li požadováno vyšetření Chol, TG, HDL-Chol, LDL-Chol, APO A1, APO B, IgM, CRP, amoniak, alkohol, ionty a osmolalita. V případě, kdy se jedná o kombinaci vyšetření z obou skupin, stanovuje se část vzorku z vyčeřeného a část z nevyčeřeného séra. Závěr: