Enzymy a Izoenzymy Petr Breinek w Enzymy 1h 2014 Enzymy enzyme „ v kvasinkách" 1926 J.Sumner: ureasa (bílkovinná povaha) 1 buňka živých organismů obsahuje až 3000 druhů enzymů • Biokatalyzátory (bílkoviny/makromolekuly,katalyzátory) • Snižují aktivační energii potřebnou pro chemickou reakci - urychlují reakce Účinnost je o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů Kdyby reakce v biologických systémech nebyly katalyzovány enzymy, byly by tak pomalé, že by nemohly zajistit existenci živé hmoty Izoenzymy Řada enzymů má stejné nebo velmi podobn katalytické účinky, liší se v primární struktuře (složením aminokyselin). Pokud tyto změny mají geneticky základ, tyto rozdílné formy jednoho enzymu mR10EL7IS0CM nazýváme izoenzymy Liší se fyzikálními, chemickými a ľľiľľľľ imunologickými vlastnostmi •— 1 2 3 4 5 6 7 Makroenzymy Pokud jsou rozdíly ve struktuře způsobené sekundárními změnami, např. ■ glykosylací ■ tvorbou komplexů s imunoglobuliny, atd. Nejsou to izoenzymy! Složení enzymové molekuly > bílkovinná část apoenzym > nebílkovinná část kofaktor Kofaktor • PrOStetická Skupina ( Mg2+, Zn2+, organické látky ve formě vitaminů,... ): pevně vázaná • Koenzym (NAD+, P5P): vázán slabě /disociovatelná molekula Místa působení: S extracelulární (krev, likvor,...) S intracelulární (cytoplazma, buněčné organely) Formy výskytu: • Rozpuštěné • Imobilizované ( např. na buněčných membránách) • Asociované (multienzymové komplexy) • Neaktivní proenzymy (zymogeny) (protrombin, pepsinogen) • Izoenzymy, makroenzymy Enzymatická reakce probíhá v několika stupních • Tvorba komplexu enzym-substrát: • Aktivace komplexu ES: • Chemická přeměna substrátu, přičemž vzniká komplex enzym-produkt: • Oddělení enzymu od reakčního produktu: E + S i ES E + P Faktory ovlivňující enzymovou reakci 1. Teplota (25-30-37 °C) 2. Pufr (pH, iontová síla, typ pufru) 3. Koncentrace substrátu a koenzymu 4. Moderátory enzymové aktivity -inhibitory (kompetitivní a nekompetetivní) -aktivátory • Na koncentraci substrátu a koenzymu • Na teplotě (doporučená teplota 37°C není však teplotou optimální !) • Na přítomnosti aktivátoru, inhibitoru) Závislost reakční rychlosti (v0) na koncentraci substrátu [S] o [S]mol Při nízkých koncentracích substrátu Při vysokých koncentracích substrátu se reakce řídí se reakce řídí • Reakce: S -> P (S = substrát, P = produkt) v A[S] A[P] At At >0 mol T7 Reverzibilní • organofosfáty • ionty těžkých kovů • kyanidy II M M kj I LU I V UM IV Cl Z. Cl I I • Rovnováha E+l o E-l • Inhibitor lze odstranit (dialýza, filtrace) Příklad: léky • Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů (HMG-CoA reduktáza) - hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) (angiotensin konvertující enzym) - léčba hypertenze (enalapril) inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií (peniciliny - inhibují transpeptidázy (výstavba buněčné stěny; tetracyklíny, makrolidy, chloramfenikol -inhibice proteosyntézy Třídění enzymů 1. Oxidoreduktázy 2. Transferázy 3. Hydro lázy 4. Lyázy 5. Ligázy 6. Izomerázy (LD, GLDH, CHOD) (AST, ALT, GGT,CK) (ALP, LPS, AMS, CHE) (NSE) (Syntetázy) Principy analytických metod stanovení enzvmů Nepřímé stanovení • katalytická koncentrace aktivity • stanoví se reakční rychlost • většina klinicky významných enzymů Přímé stanovení • hmotnostní koncentrace • stanoví se molekula enzymu jako antigén (imunochemicky) • např. tumorové markery, ALP kostní Metody stanovení katalytické koncentrace aktivity enzymu Konstantního času • Spektrofotometrické stanovení kontinuálním měřením absorbance v závislosti na čase • Průběžně se měří [S] nebo[P] • Řada měření -„dvoubodové stanovení" a - a -„end-poinť aa/aí= r . • Měří se [P] po proběhnutí reakce • Jedno měření ] 1.8 1.5-i • 1-4 c 1.3 H ť-1.2 O í 1-1 • 1 0.9 \ & 0.8 0 preinkubace vzorek měření R2 5 10 měřící body 15 20 R2-startér 25 30 1.2 0.5 vyčerpaní substrátu 0 5 10 měřicí body 15 20 R2-startér 25 30 Optický test měříme změny absorbance v UV-oblasti (při 340 nm) způsobené změnami koncentrace redukovaných forem koenzymů NADH + H+ nebo NADPH + H+ Vyjadřování výsledků měření J Katalytická aktivita enzymu jednotka katal (kat) definice: 1 kat = 1 mol/s j Katalytická koncentrace aktivity enzymu jednotka: kat/l používané jednotky: jukat/l a nkat/l jiné jednotky; U/l 1 jakat/l = 60 U/l 1 U/l = 0,0167 jukat/l • Hmotnostní koncentrace jednotky: ug/l, ng/l Jaké jsou doporučené metody? Enzym Referenční metoda Certifikovaný referenční materiál ALP IFCC metoda JC ERM 20327 AMS IFCC metoda ERM-AD456 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 AST IFCC/IRMM metoda JC-ERM 20327 ^^^^^^^^^H ALT IFCC/IRMM metoda ERM-AD454 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 IFCC/IRMM metoda ERM-AD455 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 GGT IFCC/IRMM metoda ERM-AD452 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 IFCC metoda ERM-AD453 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 LPS CHS PAMS IFCC metoda ERM-AD456 (IRMM Geel); JC-ERM 20327 ACPP^^H CKMB mass AST, ALT, AMS, ALP, CK, LD, GGT, LPS, CHE As pa rtáta m i n ot ra n sfe ráza (AST) L-aspartát + 2-oxoglutarát -o- oxalacetát + L-glutamát Je obsažena v cytoplasmě a v mitochondriích všech buněk ( zvláště hepatocytů,buněk srdečního svalu, ledvin a kosterních svalů) 25 AST EC 2.6.1.1 L-aspartát: 2-oxoglutarát aminotransferáza Klinicky význam • onemocnění myokardu (nekróza, AIM) • jaterní choroby • onemocnění kosterního svalstva AST L-aspartát + 2-oxoglutarát -o- oxalacetát + L-glutamát oxalacetát + NADH + H+ L-malát + NAD+ _MDH_ SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm • pyruvát + NADH + H+ => L-laktát + NAD+ • koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoAST => AST* • doporučuje se předinkubace 10 min při +37°C • start: 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda) • start: sérum (1 činidlová metoda) Alaninaminotransferáza (ALT) L-alanin + 2-oxoglutarát pyruvát + L-glutamát Je obsažena v cytoplasmě všech buněk, zvláště hepatocytů, buněk srdečního svalu, ledvin a kosterních svalů ALT Klinicky význam • onemocnění jater (infekční virová hepatitída, mononukleóza, chronické jaterní choroby,...) • onemocnění žlučových cest • dekompenzované srdeční vady (venostáza v játrech) • poškození svalstva ALT L-alanin + 2-oxoglutarát <=> pyruvát + L-glutamát pvruvát + NADH + H+ => L-laktát + NAD+ LD SPEKTROFOTOMETRICKY - pokles absorbance NADH při 340 nm • pyruvát + NADH + H+ => L-laktát + NAD+ • koenzym: pyridoxal-5-fosfát + ApoALT => ALT* • doporučuje se předinkubace 10 min při +37°C • start: 2-oxoglutarát ( 2 činidlová metoda) • start: sérum (1 činidlová metoda) 30 Metodika stanovení ALT Ala n in + 2-Oxoglutarát Pyri doxa Ifos fát Pyruvát + Glutamat Pyruvát + NADH + H0 LD Laktát + NAD v-sr—J optický test při reakci klesá absorbance AA/At Legenda: složky reakční směs Alfa-amyláza (AMS) štěpí a-1,4 glykozidické vazby Polysacharidy =^> Oligosacharidy => Maltóza AMS je sekreční enzym vytvářený pankreatem a slinnými žlázami, (část vzniká v játrech, plících) Sérum obsahuje přibližně stejnou katalytickou koncentraci pankreatického a slinného izoenzymu32 AMS Klinický význam onemocnění pankreatu (akutní pankreatitida) onemocnění slinných žláz ( parotitis) přítomnost makroamylasového komplexu onemocnění jater ledvinná nedostatečnost Doporučená metoda IFCC substrát: EPS-G7-PNP (EPS) 456-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1 )-a-(1,4)-D-maltoheptaosid 34 ► Maltoheptaosid 0-0-0-0-0-0-0 7 glukóz ► + a-Glukosidáza ► substráty značené 4-nitrofenolem na konci molekuly O- O- O- O- O- O- O- ■ ► na opačném konci molekuly substrátu navázána např. ethylidenová skupina =^> „blokovaný" substrát ■- O- O- O- O- O- O- 0-B 35 1 molekula EPS 4,6-ethyliden(G7)-4-nitrofenyl(G1 )- způsobuje zvýšení hodnot AMS v krevním séru 37 Metody stanovení 1. Selektivní INHIBICE isoenzymů monoklonálními protilátkami, např. stanovení pankreatické AMS 2. ELEKTROFOREZA 3. CHROMATOGRAFIE 4. IZOELEKTRICKÁ FOKUZACE 5. INHIBIČNÍ metody 38 ALP monoestery kyseliny o-fosforečné + H20 t alkohol / fenol + fosfátový anion Vyskytuje se prakticky ve všech tkáních, je součástí buněčných membrán V séru dospělých zdravých osob převažují iaterní a kostní izoenzymy (přibližně 1:1) u dětí je zvýšena aktivita kostního izoenzymu, u těhotných žen je detekovatelný placentami izoenzym a u osob s krevní skupinou 0 a B jsou přítomny stopy střevního izoenzymu. -1- 39 Hydrolýza R-OPO(OH)2 + H20 - R-OH + H3P04 TransfOSforylace (přenos fosfátové skupiny na jiný alkohol za vzniku esteru) R-OPO(OH)2 + R'-OH o R-OH + R'-OPO(OH)2 Klinicky význam: • onemocnění jater • onemocnění žlučových cest • onemocnění kostí • fyziologicky zvýšené hodnoty: rostoucí děti a těhotné ženy (max. 3 trimestr těhotenství) • zánětlivé střevní choroby 41 Metodv stanovení: Substrát: 4-NITROFENYLFOSFÁT 4-NITROFENYLFOSFÁT + H20 -^4-NITROFENOL+ fosforečnan SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE 4-NITROFENOLU při 405 nm 42 Izoenzymy ALP 1. Imunochemicky ( kostní izoALP) 2. ELEKTROFORÉZA 3. IN AKTIVAČNĚ - INHIBIČNÍ metody 4. srážení LEKTINEM ( kostní izoenzym) 43 Kreatinkináza (CK) EC 2.7.3.2 AT:kreatin-N-fosfotransferáza Kreatinfosfát + ADP o> Kreatin + ATP V cytoplazmě a mitochondriích buněk kosterního svalstva, srdce, mozku a hladké Svalovine (Poznámka: erytrocyty neobsahují CK) v myokardu: 80% CK-MM a 20% CK-MB v kosterním svalstvu: 98% CK-MM a 2% CK-MB(!) 44 Klinicky význam: • onemocnění kosterního svalstva • onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu - sledování dynamiky) • onemocnění centrální nervové soustavy (CNS) Metody stanovení: IFCC (37°C) Kreatinfosfát + AD P => Kreatin + ATP ATP + D-Glukóza => ADP + D-Glukózo-6-fosfát Hexokináza D-GLU-6-P + NADP+ => D-Glukonát-6-P+NADPH+H+ G6PD SPEKTROFOTOMETRICKY-nárůst absorbance NAD P H při 340 nm Reaktivace: N-ACETYL CYSTEIN ( NAC) 46 Izoenzymy CK CK se skládá ze 2 podjednotek (dimer; Mr=40 000): M ( muscle) a B (brain) kombinací vznikají 3 izoenzvmv:CK-MM, CK-MB, CK-BB je možné detekovat i makroenzym: CK- makro Izoformy izoenzymů: vznikají odštěpením koncových lysinových molekul CK-MB1 (žádný lysin) a CK-MB2 (1 lysin) CK-MM1 (žádný lysin), CK-MM2 (1 lysin) a CK- MM3 (2 lysiny) 47 Metody stanovení: 1. IMUNOCHEMICKY CK-MB mass (hmotnostní koncentrace) CK-MB mass: zvyšuje se asi o 1h dříve než CK-MB aktivita je kardiospecifický vyšší analytická citlivost stanovení 48 2. IMUNOINHIBICNE (nedoporučuje se) (s protilátkou proti M-podjednotkám CK) CK-MM M M +ANTI-M M M CK-MB M B M B CK-BB B B B B Předpoklad: CK-BB v séru nepřítomen (=0) potom: pokud CK-BB = 0 (nepřítomen) a CK-MM = 0 (inhibice) stanovíme aktivitu CK-B (tj.polovinu přítomného CKMB) CK-MB = 2 x CK-B 49 Laktátdehydrogenáza (LD) • Cytoplasmatický enzym, který katalyzuje reakci anaerobní glykolýzv, to vysvětluje přítomnost LD ve všech tkáních. pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+ • Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické Klinicky význam: •onemocnění srdečního svalu (infarkt myokardu, myokarditida) •onemocnění svalů •hemolytická a perniciozní anémie •onemocnění jaterního parenchymu •maligní choroby (tumory, leukémie) Zvýšení jeho aktivity v krvi není orgánově specifické —► stanovení dnes slouží spíše k vyloučení onemocnění Metodv stanovení: 1. IFCC (37°C) Substrát: L-laktát L-laktát + NAD+ pyruvát + NADH + H SPEKTROFOTOMETRICKY-nárůst absorbance NADH při 340 nm 2. Substrát: pyruvát pyruvát + NADH + H+ -+ L-laktát + NAD+ SPEKTROFOTOMETRICKY-pokles absorbance NADH při 340 nm 52 Izoenzymy LD • Aktivní enzym je tetramér - skládá se ze 4 podjednotek • Existují 2 druhy podjednotek: M( muscle/sval) a H (heart/srdce) • Kombinací vzniká 5 izoenzymů LD1 H4 LD2 H3M LD3 H2M2 LD4 HM3 LD5 M4 Detekce izo LD na elektroforeogramu L-laktát + NAD+ - pyruvát + NADH + H+ NADH + H+ + tetrazoliová sůl -+ NAD+ + FORMAZAN NBTJNT nerozpustný + PMS (fenazinmetosulfát) 55 GGT Katalyzuje přenos y-glutamvlového zbytku z y-glutamylpeptidů na jiný akceptor (např. peptid nebo aminokyselinu) GMT je vázána na cytoplasmatické membrány epitelu žlučových cest, ledvinných tubulů, jater, pankreasu, střeva, erytrocytu,...) V krvi dokazatelný enzym je převážně jaterního původu. 56 Klinicky význam: • onemocnění jater • obstrukce žlučových cest • sekundární nádory jater • monitorování chronického alkoholismu (poškození jater alkoholem) 1. IFCC (37°C) Substrát: y-L-glutamyl-3-karboxy-4-nitranilid (GLUCANE) GLUCANE + Glygly - GLU-Glygly + 5-A-2NB 5-AMINO-2-NITROBENZOÁT Glygly = GLYCYLGLYCIN 58 LPS TRI- a DIACYLGLYCEROLY + H20 -+ GLYCEROL + 3-,2 MK Výskyt: pankreatická lipáza jaterní lipáza lipoproteinová lipáza,... 59 Klinicky význam: • detekce a vyloučení akutní pankreatitidy (4-6 h, maximum 24h, 8-14 d normalizace) • chronická pankreatitida (relapsující) • obstrukce pankreatického traktu 60 2. Chromogenní štěpení syntetických substrátů a) substrát: 1,2-DIGLYCERID 1,2-diglycerid + H20 -> 2-monoglycerid + mastná kyselina 2-monoglycerid + H20 —► glycerol + mastná kyselina glycerol + ATP glycerol-3-fosfát + ADP Glycerol-3-fosfát+ 02—► dihydroxyacetonfosfát + H202 2 H202 + 4-AAP + deriv.fenolu —► 4 H20 + barevný derivát 61 b) substrát: 1,2-o-DILAURYL-rac-GLYCERO-3-GLUTARIC ACID-(6'-METHYLRES0RUFIN) ESTER DGGR (patent Roche) DGGR —► 1,2-o-DILAURYL-rac-glycerol + GLUTARIC ACID-6'-METHYLRESORUFIN ESTER GLUTARIC ACID-6'- METHYLRESORUFIN ESTER => GLUTARIC ACID + METHYLRESORUFIN chromogen SPEKTROFOTOMETRICKY: ABSORBANCE METHYLRESORUFINU při 580 nm 62 Cholinesterázy (CHE) hydrolýza estery CHOLINU + H20 - CHOLIN + příslušná kyselina • Acetylcholinesterázy acetylcholin + H20 CHOLIN + CH3COOH jsou obsaženy v erytrocytech, mozku, plících, štěpí přednostně acetylcholin (nervová zakončení) • Pseudocholinesterázy (butyrylcholinesterázy) pocházejí z ribosomů jaterních buněk -> krev —»• sérum a plazma Klinicky význam: Patologické je především snížení aktivit • poruchy proteosyntézy - těžké hepatopatie - hladovění organismu • otravy organofosfáty a karbamáty (nekompetetivní inhibitory cholinestráz) • vrozené chybění, atypické varianty Metodv stanovení: butyrylthiocholin + H20 -»thiocholin + butyrát thiocholin + DTNB => 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina žluté zbarvení DTNB = kyselina 5,5'dithio-bis-nitrobenzoová Ellmanovo činidlo Enzymy -Tumorové markery NSE (neuronspecifická enoláza) cytoplazmatický, glykolytický izoenzym enolázy (katalyzuje přeměnu 2-fosfoglycerátu na fosfoenolpyruvát) TK (thymidinkináza) enzym podílející se na syntéze DNA ukazatel buněčné proliferace 66