Extrakce
Přechod složky mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi
(separační metoda).
Extrahované látky přecházejí do fáze rozpouštědla.
1. extrakce z tuhých látek
S > složka > L
Z tuhého materiálu se rozpouští selektivně požadovaná složka
ve vhodném rozpouštědle (ostatní složky ne).
Macerace: luhování z pevných látek studeným rozpouštědlem
Digesce: macerace horkým rozpouštědlem
Aplikace:
extrakce silic, stanovení tuků Soxhletův extraktor (gif)
sekvenční extrakce
extrakce pevného vzorku
do několika různých činidel
→ frakcionace
(rozdělení do skupin)
Příklad:
městský polétavý prach
extrakce z kapaliny na pevnou fázi
L > složka > S
SPE (Solid phase extraction) – na povrchu pevné
fáze se selektivně adsorbuje z roztoku požadovaná
složka.
Provedení:
- čištění látek
- zakoncentrování
- výměna rozpouštědel
Sorbenty:
~ 50 μm částice silikagelu
s vázanou fází:
polární ( -OH, NH2
, ...)
nepolární (C8, C18, …)
Aplikace
vitamíny, pesticidy ve vodě,
kyseliny ve víně, ...
příklad aplikace SPE k přečištění nebo
zakoncentrování vzorku
extrakce z kapaliny do kapaliny
L > složka > L
Rozdělovací rovnováha požadované složky v soustavě dvou
nemísitelných kapalin
(složka přechází do kapaliny, ve které je více rozpustná).
Nernstův rozdělovací zákon:
KD
rozdělovací konstanta
(Nernstův rozdělovací koeficient)
corg
koncentrace složky v
organickém rozpouštědle
caq
koncentrace složky ve vodě
Aplikace
extrakce chlorovaných aromatických látek
extrakce organických polutantů, KOW
vytřepávání, extrakce L-L
Chromatografické metody
Distribuce látky mezi dvě fáze:
stacionární fáze
nepohyblivá - ukotvený materiál
mobilní fáze
pohyblivá - obsahuje dělené látky,
které mají různou afinitu ke stacionární fázi.
Vzorek je unášen mobilní fází.
Složky s vyšší afinitou se zachycují a zpožďují → nastává dělení.
Chromatografie - základní rozdělení
Dle povahy mobilní fáze:
● kapalinová chromatografie (MF kapalina)
● plynová chromatografie (MF plyn)
Dle uspořádání stacionární fáze:
● kolonová chromatografie (SF je umístěna v koloně)
● plošné techniky
- papírová chromatografie (SF je lokalisovaná na papíru)
- tenkovrstvá chromatografie (SF je v tenké vrstvě na podložce - sklo, Al-folie, ...)
Dle povahy převládajícího děje, který předchází separaci:
● rozdělovací chromatografie (rozdílná rozpustnost složek ve SF (l) a mobilní fázi (l, g)
● adsorpční chromatografie (rozdílná míra adsorpce složek na povrchu SF (s)
● iontově-výměnná chromatografie (rozdílné elektrostatické síly mezi funkčními skupinami
stacionární fáze – iontoměniče a ionty vzorku)
● gelová chromatografie (separace složek o rozdílné velikosti molekul podle velikosti pórů
stacionární fáze gelu – molekulově síťový efekt)
● afinitní chromatografie (na základě selektivní afinity složek vzorku ke stacionární fázi)
Plynová chromatografie (GC)
Vzorek se dávkuje do proudu plynu,
kterým je unášen kolonou.
Dělení vzorku mezi MF (plyn) a SF kapalinu
nebo tuhou látku.
MF = nosný plyn (He, N, H2
)
SF = trubice naplněné sorbenty nebo
kapiláry s pokrytou vnitřní stěnou
vhodné pro: snadno zplynitelné látky
(M<1000) - plyny, organické molekuly,
organokovové látky
Plynová chromatografie (GC) - instrumentace
zdroj nosného plynu
tlaková láhev - H, N, He, Ar
regulační systém
stálý/programově řízený průtok
dávkovač
injekční stříkačky (kapalina/plyn)
kolona
náplňové nebo kapilární
délka 1 - 60 m
detektor
tepelně vodivostní,
plamenový ionizační
Plynová chromatografie (GC) - kolony
náplňové
trubice naplněné sorbenty nebo
nosiči pokrytými kapalnou fází
průměr: 2 - 3 mm
délka: < 4 m
náplň: silikagel, alumina
kapilární
nosič SF = vnitřní stěny kapiláry
průměr: 0,1-1 mm, SF 0.25 - 5 μm
délka: 15 - 60 m
zvnější pokryta polyimidem
Plynová chromatografie (GC) - detektory
tepelně vodivostní detektor
univerzální detektor
proudící nosný plyn ochlazuje žhavené vlákno,
přítomnost jiné složky změní tepelnou vodivost
vychýlení el. odporu vlákna oproti srovnávacímu
(Wheatstoneův můstek)
plamenový ionizační detektor
spalování výstupního plynu v plameni
přítomnost složky zvýší ionizaci → proud
vhodné pro většinu látek
další typy
detektor elektronového záchytu, atomový emisní
Plynová chromatografie (GC) - pracovní postup
eluční metoda
(nejběžnější)
vzorek se jednorázově
dávkuje do proudu plynu
z kolony vychází nejdříve
nejméně zadržovaná složka
čas, za kterývyjde složka z
kolony je charakteristický (pro
identifikaci)
Plynová chromatografie (GC) - chromatogram
kvalitativní analýza
x
kvantitativní analýza
Plynová chromatografie (GC)
chromatogram whisky
Plynová chromatografie (GC)
chromatogram plynů ze vzduchu
kolona : náplňová, z nerezové oceli, 6' x 1/8'' (183 cm x 3,2 mm)
stacionární fáze : molekulové síto 5A
nosný plyn : 30 ml/min He
dávkování : 100 mL (35 °C)
teplota termostatu kolony : 35 °C
detekce : TCD (140 °C)
teoretické patro H
pomyslná část kolony, na které dochází
k ustavení rovnováhy
počet teoretických pater n
popisuje účinnost kolony
Y … šířka píku v základně
Y1/2
… šířka píku v polovině výšky
tr
… retenční čas
Účinnost separace v chromatografii
Účinnost separace v chromatografii van Deemterova rovnice
K rozšiřování zón v koloně přispívají tři děje.
Sleduje vliv rychlosti MF u na účinnost separace.
HA
Turbulentní difúze
molekuly MF protékají mezi zrnky SF.
Lineární rychlost nemá žádný vliv.
HB
Molekulární difúze
molekuly difundují do míst s nižší koncentrací
narůstá s časem → nepřímo úměrný rychlost
HC
Odpor proti převodu hmoty
molekuly pronikají různě hluboko do SF
rychlá MF způsobí, že ostatní více uniknou
→ přímo úměrný rychlost MF
planární techniky kapalinové chromatografie
Stacionární fáze na ploše;
PC - papírová chromatografie (Paper Chromatography)
TLC - tenkrovrstvá (Thin Layer Chromatography)
1. vzorek nanesen mikropipetou na start
2. podložka se okrajem ponoří do mobilní fáze
3. MF vzlíná a unáší složky (tím rychleji, čím méně se poutají k SF)
4. před dosažením konce plochy vyvíjení ukončeno a označeno čelo
Stacionární fáze:
papír (SF:voda poutaná celulosou)
tenké vrstvy zrnitého materiálu
na podložce (Al, sklo) - Al2
O3
, SiO2
Mobilní fáze:
směsi rozpouštědel (voda, alkoholy,
organické kyseliny, …)
planární techniky kapalinové chromatografie
kvalitativní analýza
planární techniky kapalinové chromatografie
chemická detekce skvrn
vedení postřiku činidlem
činidla používaná k chemické detekci skvrn
planární techniky kapalinové chromatografie
kvantitativní analýza
denzitometricky - zjišťuje se stupeň ztmavnutí v místě skrvny
kapalinová chromatografie (LC)
kolonové uspořádání
MF: kapalina (interaguje)
klasické provedení
skleněná kolona
délka ~ 50 cm
průměr ~ 2 cm
náplň
zrnitý sorbent (Al2
O3
)
MF gravitací tlačena kolonou,
složky různě sorbovány náplní
→ dělení
HPLC chromatograf
High Performance Liquid Chromatography - vysokoúčinná kapalinová chromatografie
čerpadlo (pumpa)
pístové nebo membránové
průtok ~ 1 až 10 μl/min bez kolísání,
tlak 35 MPa
dávkovací zařízení
injekční zařízení
obtokový dávkovací kohout (10 μl)
kolony
pouze náplňové, nerez
délka 10 - 25 cm,
v.průměr 0.5 cm
detektor
fotometrický, refraktometrický,
fluorescenční, vodivostní, hmotnostní
HPLC chromatograf
čerpadlo kolony šesticestný ventil
pístové, membránové
pouze náplňové
rozmanité možnosti
HPLC chromatograf - detektory
fotometrický detektor
nejběžněnší
měří se absorbce eluátu
musí být zajištěna dostatečná absorpční dráha
možnost změny vlnové délky
Lambert-Beerův zákon
A … absorbance
ε … absorpční koeficient
c … koncentrace látky
l … délka absorpční vrstvy
další detektory:
fluorescenční, refraktometrický, vodivostní
kapalinová chromatografie (LC) podle chemického principu dělení složek
kapalinová chromatografie
adsorpční chromatografie
rozdělovací chromatografie
ionexová chromatografie
gelová permeační
Adsorpční kapalinová chromatografie
princip
přitažlivé síly mezi SF a analytem
pro polární látky M<1000, SF v pevném stavu
vhodné pro: polární látky (cukry), bazické látky
adsorbenty
velký povrch, adsorpční místa
silikagel (polární kyselý)
Al2
O3
(polární bazický)
aktivní uhlí (nepolární)
mobilní fáze
nepolární analyty: nepolární MF
polární analyty: polární MF
eluční síla mobilní fáze: pentan < benzen < ethanol < aceton
retenční časy analytů: uhlovodíky < aminy < alkoholy
Rozdělovací kapalinová chromatografie
princip
rozdělení analytů mezi dvě nemísitelné kapaliny
MF unáší analyty, SF je zakotvená kapalina
vhodné pro: menší až střední molekuly; slabě až středně polární (NPC) nebo všech polarit (RPC)
>> Složka vzorku tráví více času v té fázi, ve které je rozpustnější <<
stacionární fáze
polární “normální fáze” NPC
např. voda na silikagelu
MF: nepolární (hexan)
retence roste s polaritou
nepolární “obrácené fáze” RPC
uhlovodíky na silikagelu (např. C18)
MF: polární (voda, acetonitril)
retence klesá s polaritou
Iontově výměnná chromatografie IEC
princip
působení elektrostatických sil mezi + a - ionty
dělení probíhána základě: - elektrických vlastností
- množství a druhu nabitých funkčních skupin
Ionty s vyšším nábojem
vytěsňují ty s nižším.
Stacionární fáze:
anex: kladný náboj (např. -N+
R3
, NH2
)
měnič aniontů
katex: záporný náboj (např. -SO3
,
-COO-
)
měnič kationtů
Kationty:
Ag+
> Cs+
> K+
> Na+
> H+
Anionty:
NO3
>
PO4
>
OH>
FVhodné
pro
- biochemické aplikace ( izolace bílkovin, separace nukleových kys., …)
- separace léčiv
Gelově permeační chromatografie GPC
princip
molekuly separovány podle velikosti
- jsou zadržovány v důsledku svého pronikání (permeace)
stacionární fáze:
pro látky rozpustné ve vodě: hydrofilní gely (sephadex)
pro nerozpustné ve vodě: hydrofobní gely (styragel)
vhodné pro:
analyty M > 500
proteiny
biopolymery
Volba chromatografické metody (1.: volba SF)
analyty s M>2000:
syntetické polymery: gelová permeační
biopolymery: gelová permeační, obrácené fáze
analyty s M<2000:
rozpustné ve vodě: iontové molekuly (anorg. soli): iontově výměnná ch.
disociovatelné molekuly (kyseliny, zásady): iontově výměnná ch., obrácené fáze
nedisociovatelné m. (polární sloučeniny): obrácené fáze
rozpustné v org. r.: rozpustné v methanolu (stř. polární): obrácené fáze, normální fáze
rozpustné v hexanu: obrácené fáze