Téma P05: Diagnostika Pasteurellaceae a G– nefermentujících tyčinek Ke studiu: Haemophilus, Pasteurella, Pseudomonas a G– nefermentující tyčinky (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, antigenní analýza Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Úkol 2 Kul-tiva-ce Růst na KA (A/N) Růstové charakteri-stiky na KA (ČA*) Endova p. (–/L-/L+^#) MH agar (barva) Úkol 3a Satelitový fenomén (+/–) Úkol 3b Růstové f. (X, V, X + V) Úkol 3c Pouzderný typ: Haemophilus 3d Test citlivosti Penicil. Vanko. Fermentace gluk. Úkol 4 (Hajna) Oxidázový test Úkol 5a NEFERMtest 24 Úkol 5b KONEČNÝ ZÁVĚR *Pro bakterie nerostoucí na krevním agaru (KA) použijte čokoládový agar (ČA) ^#Neroste/roste a nefermentuje laktózu/roste a fermentuje laktózu Úkol 1: Mikroskopie suspektních kmenů Na stole máte kmeny popsané písmeny. Obarvěte je podle Grama, a do tabulky vepište výsledky. Kmen, který NENÍ G– tyčinka, nebude studován v úkolech 3 až 5 (ale v Úkolu 2 si ho pro srovnání popište) Úkol 2: Kultivace na agarových půdách Nejdříve napište, které bakterie rostou na krevním agaru a které ne. Pak, používajíce standardních procedur, popište kolonie všech kmenů na krevním agaru. Pouze ty, které na KA nerostou, popište na čokoládovém agaru. Poté popište růst na Endově půdě (stačí „–“ pokud nerostou a „+“ pokud rostou; fermentaci laktózy nelze posuzovat, neboť kmeny jsou naočkovány na osminy a netvoří izolované kolonie). Na MH agaru hodnoťte pouze jeden z kmenů, a to pouze z hlediska případného pigmentu (miska slouží i pro úkol 6b – testování citlivosti). *demonstrační misku s naočkovanými, avšak nevyrostlými kmeny, naleznete na bočním stole Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae a jejich přesnější určení a) Satelitový fenomén Hemofily jsou typické takzvaným satelitovým fenoménem. To znamená, že samy o sobě nerostou na krevním agaru, ale jsou tam schopny růst v přítomnosti kmene, který pro ně z krvinek uvolní růstové faktory. Pro tento účel se zpravidla používá kmen Staphylococcus aureus. Zakreslete satelitový fenomén a spojte popisky s příslušnými jevy na obrázku Staphylococcus aureus Kolonie hemofilů b) Identifikace hemofilů podle potřeby růstových faktorů Určete dané kmeny podle potřeby růstových faktorů. Zakreslete výsledek faktorového testu pro oba kmeny. c) Detekce kapsulárních antigenů H. influenzae Popište výsledek aglutinace kapsulárních antigenů H. influenzae pomocí latexové aglutinace (z prezentace). d) Detekce P. multocida pomocí typického vzorce citlivosti Velmi typická pro P. multocida je její citlivost k penicilinu, velmi vzácná u G– tyčinek. Na druhou stranu je rezistentní k mnohem silnějšímu (ovšem pouze pro G+ bakterie vhodnému) antibiotiku vankomycinu. Zapište. Úkol 4: Hajnova půda Prohlédněte si kultivační výsledky čtyř kmenů na Hajnově půdě. Kmen, který fermentuje glukózu (žlutá barva) označte jako „+“, kmeny nefermentující (červená) jako „–“ Úkol 5 Určení G– glukózu nefermentujících bakterií a) Oxidázový test Demonstrace oxidázového testu u tří kmenů určených jako G– nefermentující bakterie. Zapište výsledky do tabulky. (Pseudomonas je vždy pozitivní, Burkholderia většinou, ale ne nutně pozitivní; na druhou stranu, Stenotrophomonas bývá zpravidla negativní). Oxidáza pozitivní bakterie s typickou vůní a pigmentem (zpravidla zeleným, řidčeji modrým či zrzavým) je prakticky s jistotou Pseudomonas aeruginosa. U této bakterie tedy není nutno provádět další biochemické testování, popsané v úkolu 5a. U ostatních dvou kmenů je toto biochemické testování nezbytné. b) Podrobné biochemické testování Vyhodnoťte předložené výsledky NEFERMtestu 24, který byl připraven DVA dny předem (rozdíl oproti jiným biochemickým testům, kde je to jen jeden den) při 30 °C (další rozdíl; jiné testy vyžadují 37 °C). Také způsob odečítání testu je jiný, protože zde máme tři řady. Testy v horní řadě mají vždy hodnotu „1“, v prostřední „2“ a v dolní „4“. První číslice je z oxidázového testu: „0“ pro negativní, „1“ pro pozitivní oxidázu. Z reakcí v důlcích B a A se číslice nevypočítávají. Máme tedy sedmimístný kód – první pozice je „0“ (oxidáza –) nebo „1“ (oxidáza +) a dalších šest může nabývat hodnot 0 až 7 dle výsledku testů ve sloupcích H až C. Kmen: OX H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Kmen: OX H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Poznámky: Úkol 6: Testy citlivosti patogenů na antibiotika Mezi vašimi bakteriemi je pět patogenních: dvě z čeledi Pasteurellaceae a tři G– nefermentující. Z nich však budete měřit velikosti zón jen pro pseudomonádu. Zapište celé názvy antibiotik a změřte velikost zón. Zapište kmeny jako citlivé (C) resistentní (R) a intermediární (I). 6a) Test pro Pasteurellaceae Kmen Antibiotikum (celé jméno) Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Velké, splývající zóny není potřeba měřit, hodnoťte rovnou jako „citlivé“. *platí i pro doxycyklin Interpr. Ampicilin (AMP) C ≥ 16 / R < 16 Ko-amoxicilin (AMC) C ≥ 16 / R < 16 Cefuroxim (CXM) C ≥ 25 / R < 25 Chloramfenikol (C) C ≥ 28 / R < 28 Tetracyklin (TE)* C ≥ 25 / R < 22 Ko-trimoxazol (SXT) C ≥ 23 / R < 20 6b) Test pro pseudomonádu (jako pseudomonáda byl určen kmen ___) Antibiotikum Æ zóny (mm) Interpr. Antibiotikum Æ zóny (mm) Interpr. Piperacilin+tazobaktam (TZP) C ≥ 18 / R < 18 ciprofloxacin (CIP) C ≥ 25 / R < 22 gentamicin (CN) C ≥ 15 / R < 15 ceftazidim (CAZ) C ≥ 16 / R < 16 ofloxacin (OFL) C ≥ 16 / R < 13 kolistin (CT) C ≥ 11 / R < 11 Poznámka: Tazobaktam působí jako inhibitor betalaktamázy, zároveň ale má i svoji vlastní antimikrobiální účinnost. 6c) Kontrola primárních rezistencí u kmenů burkholderie a stenotrofomonády Ve výše uvedené tabulce přirozených rezistencí, vydané organizací EUCAST, vidíte přirozené rezistence u nejběžnějších gramnegativních nefermentujících bakterií. Na bočním stole vidíte testy citlivosti u burhkolderie a stenotrofomonády. Abyste nemuseli měřit zóny, jsou zde již zaznačeny referenční zóny, takže jen porovnejte, zda reálná zóna je či není větší než referenční zóna zakreslená fixou. Do textu na další stránce zapište dle tabulky EUCAST antibiotika, na která je daný druh bakterie primárně rezistentní – vyberte je ale pouze z těch šesti, na která byly naše kmeny testovány. Dále zapište, zda testované kmeny na bočním stole jeví všechny přirozené rezistence, které mají vykazovat (v tom případě „souhlasí“ a není třeba více vypisovat), nebo některou z nich nevykazují; v takovém případě napište antibiotikum nebo antibiotika, která nesouhlasí. Zapište: Kmen ___ (S. maltophilia) by měl být primárně rezistentní na tato antibiotika: __________________________ _________________________________________________________________________________________. Citlivost zjištěná difusním diskovým testem s tímto souhlasí nesouhlasí v případě tohoto antibiotika či těchto antibiotik: _______________________________________ Kmen je citlivý na antibiotika: _________________________________________________________________ Kmen ___ (B. cepacia) by měl být primárně rezistentní na tato antibiotika: ___________________________ _________________________________________________________________________________________. Citlivost zjištěná difusním diskovým testem s tímto souhlasí nesouhlasí v případě tohoto antibiotika či těchto antibiotik: _______________________________________ Kmen je citlivý na antibiotika: _________________________________________________________________ Poznámka: V praxi, pokud citlivost nesouhlasí (kmen vyjde jako citlivý ačkoli by měl být primárně rezistentní), považuje se i tak za rezistentní. Pokud je však diskrepancí více, je zpravidla vhodné ověřit citlivost kvantitativními testy, případně zkontrolovat, zda bylo správně provedeno rodové a druhové určení kmene. Úkol 7: Vztahy bakterií ke kyslíku – porovnání enterobakterií, G– nefermentujících a anaerobů Podívejte se na bujóny kultivované za aerobních a anaerobních podmínek (vrstva parafinu na povrchu), vyhodnoťte růst bakterií a jeho charakter. Kmen Růst v bujónu Růst ve VL bujónu Závěr Úkol 8: Diferenciální diagnostika patogenních bakterií (opakování témat P04 a P05) Úkol 8a: Po přečtení kazuistiky uveďte do následující tabulky klinický materiál, který byste příslušnému pacientovi odebrali a zaslali do laboratoře. Signifikantní údaje v kazuistice: Klinický materiál: Úkol 8b: V přiložené tabulce vyberte požadovaná kultivační vyšetření, která považujete v dané situaci za opodstatněná, a stručně popište výsledek: Popište výsledek Mikroskopie □ Nechci provést □ Chci provést □ mikroskopii vzorku □ mikroskopii kmene Kultivace □ Nechci provést □ Chci provést □ Bujón □ VL bujón □ Selenitový bujón □ Krevní agar □ VL agar □ KA + 10 % NaCl □ Čokoládový agar □ Slanetz-Bartley □ Levinthalův agar □ Endův agar □ XLD □ Sabouraudův agar □ Löwenstein-Jenssenův agar □ URI select □ půda pro kampylobaktery □ Uveďte další půdy: Úkol 8c: Na základě předešlých údajů uveďte předpokládanou skupinu bakterií a vyberte doplňkové testy: Skupina bakterií Popište výsledek doplňkového testu □ kataláza □ oxidáza □ PYR test □ CAMP □ test citlivosti k optochinu □ hyaluronidáza □ INAC □ Hajnova půda □ Arabinóza □ růstové faktory □ další: Biochemický test □ Nechci provést □ Chci provést (uveďte název testu) Napište výsledek testu, index typičnosti a procento pravděpodobnosti: Antibiotická citlivost □ Nechci provést □ Chci provést Napište antibiotika, na která je kmen citlivý: Úkol 8d: Uveďte název identifikované bakterii a doporučenou léčbu: Název: Doporučená léčba: