Téma XP07–8: Diagnostika anaerobních bakterií, tuberkulózy, aktinomycet a nokardií Ke studiu: Clostridium; nesporulující anaeroby (učebnice, WWW atd.), Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, pokus na zvířeti, neutralizace, antimikrobiální citlivost, PCR Úkol 1: Mikroskopie acidorezistentních a částečně acidorezistentních mikroorganismů Zatímco acidorezistentní mikroorganismy (Mycobacterium) nelze barvit dle Grama, mikroby acidorezistentní pouze částečně (Actinomyces, Nocardia) mohou být Gramem obarveny, ale barví se nekonstantně, a také nabývají větvených filamentózních forem. a) Barvení (negativního) klinického materiálu barvicí metodou dle Ziehl-Neelsena ________________________________________________________________________________ Ziehl-Neelsenovo barvení se používá u mykobakterií (M. tuberculosis, M. leprae), ale také u některých parazitů (Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis). Acidorezistentní organismy se barví pouze při zahřátí*, avšak zato je pak neodbarví ani tzv. „kyselý alkohol“ (roztok alkoholu s HCl nebo H[2]SO[4]). Poté je odbarvené pozadí obarveno kontrastní barvou. Obarvěte negativní vzorek sputa de Ziehl-Neelsena (varianta s methylenovou modří). Mikroskopujte. Zde acidorezistentní tyčinky nenaleznete. Zakreslete výsledky, uvidíte především přirozené pozadí, tj. leukocyty, epitelie a další objekty. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). Popište také barvicí proceduru – do následující tabulky zapište názvy činidel používaných při barvení 1. Během barvení se preparát , dokud 2. Činidlo je směsí a 3. Místo tohoto barviva lze použít také b) Mikroskopie mykobakteriální kultury ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si v mikroskopu (imerze, imerzní objektiv) mykobakteriální kulturu barvenou dle Ziehl-Neelsena. Zaznamenejte zejména přítomnost acidorezistentních tyčinek. Zakreslete pozorované. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). c) Mikroskopie kmenů aktinomycet a nokardií ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si mikroskopicky Gramem barvené sklíčko. Popište a zakreslete pozorované objekty. Povšimněte si velkého polymorfismu organismů (od kokovitého tvaru přes tyčinky až po vlákna, často větvená); grampozitivní, ale často až gramlabilní). Opět obrázek i popište. Úkol 2: Kultivace mykobakterií, aktinomycet a nokardií Kultivační nároky acidorezistentních a částečně acidorezistentních bakterií jsou velmi různorodé. v Pro Mycobacterium tuberculosis používáme tekuté (Šula, Banič) a pevné půdy (Ogawa, Löwenstein-Jenssen). Pevné půdy se liší od většiny půd používaných v bakteriologii, protože neobsahují agar; jejich „pevnost“ je dána koagulovanou vaječnou bílkovinou. Před kultivací je nutno vzorky mořiti. v Pro rod Nocardia postačuje běžný krevní agar. v Pro rod Actinomyces je nutný VL-agar a kultivace v anaerostatu či anaerobním boxu (viz P07), protože jsou anaerobní, případně mikroaerofilní, ale s tak malou potřebou kyslíku, že jim toto vyhovuje. *Zahřátí lze případně nahradit použitím vysoce koncentrovaného karbolfuchsinu a vysoce koncentrovaného fenolu; tato modifikace Ziehl-Neelsenova barvení (dle Kinyouna) nevyžaduje zahřívání. a) Popište půdy pro kultivaci mykobakterií Název půdy tekutá/pevná barva poznámky b) Popište a zakreslete růst kolonií rodů Mycobacterium, Actinomyces a Nocardia na (v) daných médiích Baktérie Název půdy Přítomnost/nepřítomnost růstu, případně charakterizace růstu (charakterizujte růst vlastními slovy) Mycobacterium Actinomyces krevní agar VL agar Nocardia krevní agar VL agar Úkol 3: Určení citlivosti na antimikrobiální látky K léčbě mykobakteriálních infekcí se používají speciální léky zvané antituberkulotika. Liší se také způsob testování citlivosti: antituberkulotika se přímo přidávají do půdy. Zato infekce působené rody Actinomyces a Nocardia se léčí „normálními“ antibiotiky a citlivost se testuje „normálním“ difusním diskovým testem. a) Určení citlivosti mykobakterií na antituberkulotika Porovnáním s kontrolní zkumavkou odečtěte testy citlivosti kmenů mykobakterií na antituberkulotika. Antituberkulotikum Kontrola růstu Růst A/N Interpretace b) Citlivost na antibiotika u kmenů Nocardia a Actinomyces Testování citlivosti na antibiotika u nokardií a aktinomycet se provádí klasickým difusním testem, ovšem kvůli růstovým vlastnostem těchto bakterií používáme půdy s krví. V tomto spojeném praktiku testy citlivosti neprovádíme. Úkol 4: PCR v diagnostice TBC Jelikož je kultivace mykobakterií obtížná, stává se PCR velmi důležitou diagnostickou metodou. Odečtěte výsledek PCR TBC (z prezentace), zapište a interpretujte výsledky Pacient č. Proužek vzorku Interní kontrola Interpretace 1 2 3 4 Úkol 5: Diagnostika lepry Lepra je nemoc, která stále postihuje miliony lidí v méně rozvinutých zemích. Její diagnostika je obtížná. Vyplňte následující tabulku. Toto zvíře se jmenuje Používá se k výrobě a tato látka se používá při Zdroj obrázku: http://www.1-costaricalink.com/costa_rica_fauna/nine_banded_armadillo.htm Úkol 6: Nepřímý průkaz TBC pomocí testu QUANTIFERON^©-TB Gold Jde o test vyšetření indukovaného uvolňování interferonu gama k ověření buněčné imunity. Princip testu: Bylo prokázáno, že při tuberkulóze, a to i latentní, dochází k tomu, že tuberkulózní antigeny aktivují T-lymfocyty a ty tvoří velká množství interferonu gama. Podobně lze tyto T-lymfocyty aktivovat nespecificky např. takzvaným mitogenem, ten se proto používá jako pozitivní kontrola (MIT). Jako negativní kontrola je použita zkumavka, která nic neobsahuje (NIL). Hodnota „TB“ představuje množství uvolněného interferonu po stimulaci vlastním antigenem TBC. Samotný interferon je přitom detekován pomocí reakce ELISA. Interpretujte vyšetření testem Quantiferon-TB Gold u čtyř pacientů s využitím interpretační tabulky. Anna: MIT = 4,8 TB = 1,2 NIL = 1,1 Vaše interpretace: _____________________ Berta: MIT = 5,3 TB = 4,8 NIL = 2,1 Vaše interpretace: _____________________ Cecil: MIT = 0,9 TB = 0,9 NIL = 0,8 Vaše interpretace: _____________________ Dimos: MIT = 8,4 TB = 8,3 NIL = 8,2 Vaše interpretace: _____________________ (všechny hodnoty jsou uvedeny IU/ml) Interpretační tabulka (podle doporučení k testu, zjednodušeno!) NIL TB mínus NIL MIT mínus NIL Konečná interpretace testu Přítomnost infekce M. tuberculosis ≤ 8,0 < 0,35 ≥ 0,5 negativní Nepravděpodobná ≥ 0,35 jakákoli hodnota pozitivní Pravděpodobná < 0,35 < 0,5 nejistá Nelze určit > 8,0 jakákoli hodnota jakákoli hodnota Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 4 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N Gramovo barvení – Úkol 1b (včetně případných údajů o tvorbě spor) Kultivace: úkol 3 2 Krevní (“KA”) Růst A/N VL agar (“VLA”) Růst A/N VL bujón Růst A/N Popis kolonií na KA/VLA* KONEČNÝ ZÁVĚR (výsledek Úkolu 4 – ANAEROtest, nebo, u „ne-anaerobů“, výsledky předchozích testů) *Použijte VLA (VL agar) u bakterií, které nerostou na krevním agaru Úkol 11: Mikroskopie klinického vzorku a mikroskopie kmene a) Prohlídka klinického vzorku ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si Gramem barvený preparát. Pravděpodobně najdete směs různých bakterií, jak je to u anaerobních infekcí typické: za infekci nemůže jeden patogen, ale směs patogenů. Vedle bakterií můžete vidět leukocyty (zejména polymorfonukleráry), případně epitelie, tkáňovou drť a tak dále. Nezapomeňte obrázek popsat (použijte čáry)! b) Mikroskopie podezřelých kmenů Anaerobní bakterie mohou být koky i tyčinky, grampozitivní i gramnegativní; v tom se neliší od jiných bakterií. Bývají ale pleomorfnější. U rodu Clostridium je přítomnost a pozice endospor užívána jako významný diagnostický znak. Pokuste se u jednoho z vašich kmenů (robustní G+ tyčinky) endospory najít. Úkol 12: Anaerostat a anaerobní box K získání anaerobiózy používáme v naší laboratoři tři způsoby: a) pro tekuté půdy se jako bariéra médium/atmosféra používá parafinový olej (není dokonalé) b) pevné půdy dáváme do anaerostatu, kde je kyslík chemicky nahrazen směsí plynů c) pevné půdy lze také umístit do anaerobního boxu; anaerobní atmosféra je vháněna z bomby. Vepište do obrázků svůj popis (anaerostat uvidíte doopravdy a spolu s anaerobním boxem také na obrázku). Úkol 13: Kultivace na agarových půdách Popište kultivační výsledky daných kmenů na aerobních i anaerobních půdách. a) Aerobní kultivace na krevním agaru (KA) Napište, zda bakterie rostou či nikoli, případně též popište jejich kolonie. b) Anaerobní kultivace na VL agaru (VL krevním agaru) VL (krevní) agar je podobný krevnímu agaru, ale má snížený redoxní potenciál a kultivuje se v anaerostatu či anaerobním boxu. Napište, které kmeny zde rostou a ty, které nerostly na KA, popište. c) Pomnožení anaerobů ve VL bujónu VL bujón se používá pro pomnožení málo početných anaerobních bakterií. Zkontrolujte přítomnost zákalu (růstu) ve VL bujónu a porovnejte s výsledky části b). Úkol 14: Druhová diagnostika anaerobů biochemickými testy U kmenů určených jako anaeroby používáme biochemický mikrotest (ANAEROtest 23 Erba-Lachema) naočkovaný o dva dny dříve. Vzhledem k tomu, že způsob odečítání odpovídá odečítání NEFERMtestu 24 (snad s výjimkou toho, že výsledek je těžší najít v kódové knize, která je rozdělena na čtyři části), není nutné zařadit jeho odečet do tohoto spojeného praktika. Do výsledku tabulky tedy zapíšeme pouze „G– anaerobní tyčinky“ či „G+ spirálující tyčinky“ bez rodového a druhového určení. Úkol 15: Citlivost anaerobů na antibiotika Odečtěte E-test na anaerobní bakterii. Zakreslete a vyhodnoťte výsledek. Nezapomeňte, že i když je principiálně podobný jako difusní diskový test, je E-test kvantitativním testem. Hodnoty koncentrací jsou napsány přímo na proužku. Místo, kde okraj zóny kříží proužek, nám ukazuje hodnotu minimální inhibiční koncentrace (MIC). Testovaný kmen Testované antibiotikum / antimykotikum Hodnota MIC Breakpoint: Závěr (kmen je citlivý/rezistentní k danému antibiotiku) Poznámka k Úkolu 15: Anaerobní bakterie bývaly testovány difusním diskovým testem, avšak bylo prokázáno, že difusní diskový test není pro anaerobní bakterie dostatečně spolehlivý. V současnosti se dle instrukcí EUCAST se infekce způsobené anaerobními bakteriemi buďto léčí bez in vitro testování, nebo, zvláště u závažných infekcí, se k in vitro testování používají E-testy. Úkol 16: Detekce toxinů klostridií U klostridií se používají různé testy produkce toxinu. a) Průkaz toxinu (lecitinázy) Clostridium perfringens Clostridium perfringens tvoří specifickou lecitinázu, neutralizovatelnou specifickou protilátkou. Polovina vaší misky je potřena protilátkou (anti-lecitinázou), druhá potřena není. Toxický efekt lecitinázy spatříte jako oblast precipitace kolem kmene na žloutkovém agaru. Pravý toxin je neutralizován antitoxinem, jiné lecitinázy neutralizovány nejsou. Zakreslete výsledek do obrázku a přičiňte popis. b) Průkaz toxinu Clostridium tetani Zakreslete (dle prezentace) obrázek tetanické myši. Povšimněte si pozice ocásku a končetin. c) Detekce A a B toxinů Clostridium difficile Pseudomembranózní kolitida způsobená toxiny Clostridium difficile je velmi nebezpečná, zejména u hospitalizovaných pacientů. Testování se provádí imunochromatografickým testem, který již byl prováděn v praktiku J09. Pro praxi je důležité, že na toto vyšetření je nutno zasílat kusovou stolici (NESTAČÍ výtěr z řiti). Prohlédněte výsledek průkazu toxinů A + B Clostridium difficile ve vzorcích stolice X a Y a zapište výsledky: Vzorek X je pozitivní – negativní Vzorek Y je pozitivní – negativní