Lipidy 1 Lipidy • Lipos = tuk •Význam lipidů v organismu • 1) Zdroj zásobní energie alternativní ke glukóze (triacylglyceroly) • 2) Součást buněčných membrán (cholesterol, fosfolipidy) • 3) Biokatalyzátory, hormony • 4) izolační vrstva, ochrana orgánů •Stanovení koncentrace lipidů v krvi nyní bez významu (referenční rozmezí 4,0 - 8,0 g/l) • 2 3 Rozdělení lipoproteinů 4 Lp(a) • Lipoprotein o nízké hustotě • Kromě Apo B100 má navíc Apo(a) • Apo(a) je podobný plasminogenu • Polymorfismus (hustotní a délkový) • Koncentrace Lp(a) v krvi dána geneticky 5 Stanovení lipoproteinů 1) ULTRACENTRIFUGACE LPultracentrifugace 6 2) ELEKTROFORÉZA 7 3) SELEKTIVNÍ PRECIPITACE LP rutinni 8 Stanovení ApoAI a ApoB 1) IMUNOTURBIDIMETRIE 2) IMUNONEFELOMETRIE • Referenční metody nejsou definovány • CRM: SP1-01 a SP3-07 Cholesterol • • • • 9 chol bílá krystalická látka 10 Cholesterol celkový = Cholesterol +Cholesterol esterifikovaný Stanovení cholesterolu •1. Referenční metoda (ID-GC/MS) • 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem • 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií • 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony • • kalibrátor NIST-SRM 911b • vnitřní standard (3,4-13C2) cholesterol • derivatizace TMS(trimethylsilylether) • m/z analyt 458 • m/z vnitřní standard 460 • CV(průměr) 0,8% • bias -0,5% (-1,4 až + 0,5%) • •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 11 Cholesterol • • 2. Enzymové stanovení • •Hydrolýza esterů cholesterolu • (CHE, cholesterolesterasa) •Oxidace cholesterolu • (CHOD, cholesteroloxidasa) •Barevná reakce (oxidační kopulace) • (POD, peroxidasa + chromogen, Trinderova reakce) • 12 • • • •estery cholesterolu + H2O « cholesterol + mastné kyseliny (CHE) • cholesterol + O2 « Δ4-cholesten-3-on + H2 O2 (CHOD) • • • H2 O2 + chromogen « H2 O2 + barvivo (POD) • • • •H2 O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu « chinoniminové barvivo + 4 H2O • • • • • 13 Stanovení HDL cholesterolu 1.Referenční metoda • Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu • • 1) odstranění VLDL ze séra ultracentrifugací • 2) odstranění IDL,LDL, a Lp(a) precipitací činidlem MnCl2+heparin a centrifugací • 3) stanovení cholesterolu v supernatantu • referenční metodou Abell-Kendall • • • Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 14 HDL cholesterol •2. HOMOGENNÍ (přímé) metody • a)Imunoseparace (Wako) • (protilátky proti lidským ß-lipoproteinům b)Maskování (Daiichi) • (polyanionové polymery) c)Modifikované enzymy a maskování (Kyowa) • (enzymy modifikované PEGem + sulfáty cyklodextrinu) 15 Stanovení LDL cholesterolu 1.Referenční metoda • Preparativní ULTRACENTRIFUGACE v hustotním gradientu • • 1) odstranění VLDL a chylomikronů ze séra ultracentrifugací (v supernatntu zůstane směs LDL+HDL o hustotě nad 1,006 kg/l) • 2) stanovení cholesterolu v supernatantu (LDL+HDL) Abell-Kendallovou metodou • 3) odstranění LDL precipitací činidlem MnCl2-heparin • v druhé části supernatantu • 4) stanovení cholesterolu po centrifugaci v supernatantu (HDL) Abell-Kendallovou metodou • 5) výpočet LDL cholesterolu podle vztahu: • LDLChol=(LDL+HDL)Chol - HDLChol •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 16 LDL cholesterol •2. HOMOGENNÍ(přímé) metody • •a) metody s maskováním non-LDL částic • •maskování VLDL a chylomikronů cyklodextrinsulfátem •oddělení HDL od LDL detergentem •stanovení cholesterolu v LDL •detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení • 17 •b) metody s odstraněním non-LDL částic • •Rozložení non-LDL částic za přítomnosti detergentu a polyaniontu, za přítomnosti CHE a CHOD proběhne stanovení cholesterolu na peroxid vodíku, který je rozložen katalasou bez tvorby zbarvení •po přidání 2.reagencie obsahující detergent dojde k solubilizaci LDL a enzymovému stanovení cholesterolu z LDL částic (detekce peroxidu vodíku za tvorby zbarvení) • 18 •3. Výpočet koncentrace LDL cholesterolu(Friedewald) • •LDLChol(mmol/l) = Celkový Cholesterol - HDLChol - 0,45.TG • •nutné stanovit HDLcholesterol, celkový cholesterol a TG •neplatí při hyperTG •požadavek 12-14h lačnění • • • • • 19 20 Triacylglyceroly • • • Triacylglyceroly = estery glycerolu Problémy při stanovení: volný glycerol diacylglyceroly monoacylglyceroly Odběr krve musí být nalačno (12 až 14h) Stanovení triacylglycerolů •1. Referenční metoda (ID-GC/MS) • 1) izotopová diluce značeným vnitřním standardem • 2) separace neznačeného a značeného analytu plynovou chromatografií • 3) detekce hmotnostní spektrometrií po eluci z kolony • kalibrátor NIST-SRM 1595 tripalmitin • vnitřní standard (13C3) tripalmitin • derivatizace N-ethyl-N-trimethylsilylfluoroacetamid) • m/z analyt 215 hlavní měření • 185,231(konfirmační měření) • m/z vnitřní standard 218-187,234(konfirmační měření) • CV(průměr) 0,57% nativní sérum-0,72% lyof. sérum • bias(diference od SRM 909) 0,10-0,25% lyofilizované sérum • 0,14-0,45% nativní sérum •Klin.Biochem.Metab.,6(27)1998,1,50-56 21 Triacylglyceroly •2. Enzymové stanovení •Hydrolýza (vznik glycerolu) •Fosforylace (vznik glycerol-3-fosfátu) • a)Oxidace glycerol-3-fosfátu • barevná reakce b)Stanovení ADP • stanovení pyruvátu (optický test) • – 22 • •triacylglyceroly + 3H2O « glycerol + 3 mastné kyseliny • LIPASA •glycerol + ATP « glycerol-3-fosfát + ADP • GLYCEROLKINASA (GK) • •glycerol-3-fosfát + O2 « dihydroxyacetonfosfát +H2O2 • GLYCEROLFOSFÁTOXIDASA (GPO) • •2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + derivát fenolu « chinoniminové barvivo + 4 H2O • PEROXIDASA (POD) • 23 • • •glycerol + ATP « glycerol-3-fosfát + ADP • GLYCEROLKINASA (GK) • •ADP + fosfoenolpyruvát « ATP + pyruvát • PYRUVÁTKINASA (PK) •pyruvát + NADH +H+ « laktát + NAD + • LAKTÁTDEHYDROGENASA (LD) • 24 25 Analyt Muži Ženy Cholesterol (mmol/l) 2,90 5,00 2,90 5,00 LDL cholesterol (mmol/l) 1,20 3,00 1,20 3,00 HDL cholesterol (mmol/l) 1,00 2,10 1,20 2,70 Apo A1 (g/l)* 1,00 1,70 1,10 1,90 Apo B (g/l)* 0,50 1,00 0,50 1,00 Klinická biochemie a metabolismus, 1 (2010) 45-46