Speciální koagulační
vyšetření II
Přirozené inhibitory
Antitrombin
Systém PC/PS (ProC Global)
Protein C
Protein S
APC-rezistence
Antitrombin
Vyšetření funkční aktivity
fotometricky (IIa, Xa)
Vyšetření antigenu
u vrozených defektů
LIA, EID, ELISA
Systém proteinu C
XIIa
FVIIa-TF XIa FVIIIi
FIXa
FVIIIa FVIII
FX FXa FX FVi
FVa FV
FII FIIa
fibrinogen FIBRIN Ca2+
TM PC APC PS
Protein C
Vyšetření funkční aktivity
koagulační metody
fotometrické
Klinický význam - snížení
Normální hodnoty
60 - 130 %
Vyšetření antigenu
u vrozených defektů
EID, ELISA
Protein C – koagulační metoda
Stanovení prodloužení koagulačního času
(APTT) způsobené inaktivací F VIIIa a Va
aktivovaným proteinem C.
Postup
ředěná vyšetřovaná plazma + aktivátor proteinu C
neředěná protein C deficitní plazma
APTT reagencie, inkubace
CaCl2
stanovení koagulačního času
odečtení funkční aktivity z kalibrační křivky
lin/lin závislost
vyjádření výsledku
% normálu
Protein C- fotometrická metoda
Sledování vzniku zbarvení v důsledku štěpení
specifického chromogenního substrátu
aktivovaným proteinem C.
Postup
ředěná vyšetřovaná plazma + aktivátor proteinu C
specifický chromogenní substrát
sledování vzniku zbarvení
 kineticky ( A/min)
„end point“ (A)
odečtení funkční aktivity z kalibrační křivky
lin/lin závislost
vyjádření výsledku
% normálu
Protein S
Vyšetření funkční aktivity
koagulační metody
Klinický význam - snížení
Normální hodnoty
muži 65 - 140 %
ženy 50 - 140 %
Vyšetření antigenu - volný, celkový
LIA
ELISA
EID
Protein S – koagulační metoda
Stanovení prodloužení koagulačního času (PT)
způsobené inaktivací Va systémem PC (PS +
aktivovaný PC).
Postup
ředěná vyšetřovaná plazma
neředěná protein S deficitní plazma
aktivovaný PC
PT reagencie
stanovení koagulačního času
odečtení funkční aktivity (%) z kalibrační křivky
lin/lin závislost
Rezistence na aktivovaný PC
= snížená antikoagulační odpověď na aktivovaný PC (APC)
 Příčinou vrozené APC-R je ve většině případů
Leidenská mutace faktoru V (FVL)
 Příčinou získané APC-R
 zvýšení F VIII
 LA
 těhotenství, hormonální substituce (včetně HAK)
 antikoagulační léčba
 významné defekty PC a PS
 nesprávné zpracování vyšetřované plazmy
Možnosti vyšetření APC -
rezistence
 Vyšetření fenotypu
koagulačními metodami
průkaz vrozené i získané APC-R
 Vyšetření genotypu
molekulárně genetické stanovení FVL
Koagulační vyšetření APC - R
 Vyšetření prodloužení koagulačních časů po
přídavku APC
1. Vyšetření dvou koagulačních časů
 s přídavkem a bez přídavku APC
 vyjádření výsledku
– poměr R = t s APC / t bez APC (norma např. > 2,0)
2. Vyšetření jednoho koagulačního času
 s přídavkem APC
 vyjádření výsledku
– koagulační čas (norma: časy > cut off (např.120 s)
ProC Global
globální funkční test
stanovení antikoagulační kapacity systému PC
nejen APC-R
Použití
ke screeningu vrozených i získaných poruch
Princip
test na bázi APTT s použitím aktivátoru proteinu C hadího
jedu (Agkistrodon contortree), který aktivuje
endogenní PC přítomný v testovaném vzorku
sleduje se prodloužení APTT indukované
aktivovaným endogenním PC
ProC Global - výsledky
Vyšetření dvou koagulačních časů
aPTT v přítomnosti aktivátoru proteinu C
aPTT bez aktivátoru proteinu C
Výsledek - normalizovaný poměr (NR)
 vztažení poměru časů R ke standardě
Normální hodnoty NR > 0,8
Předpokládá se, že snížení poměru je v
závislosti na riziku trombózy
ProC Global
Test je citlivý na defekty v systému
proteinu C (95 %)
Leidenská mutace faktoru V (100 %)
defekt proteinu C (85 %)
defekt proteinu S (56 %)
Zachycuje vrozenou i získanou APC-R
I samotná pozitivita PCG (bez známé
příčiny) zvyšuje riziko VT (4x)
Vhodný test pro screening trombofílie
nikoli jako diagnostický test
Testy k diagnostice VWF
 doba krvácení
 PFA
 APTT
 F VIII:C (funkční aktivita)
 funkční aktivita VWF (VWF:RCo, VWF:Ac)
 antigen VWF (LIA, ELISA, EID)
 agregace po ristocetinu
 kolagen vazebná kapacita VWF
 F VIII vazebná kapacita VWF
 multimerní struktury VWF
 molekulární diagnostika
Vyšetření aktivity VWF
Metody stanovení schopnosti vazby VWF na GPIb
vyšetření ristocetin kofaktorové aktivity (VWF:RCo)
metody ristocetin nezávislé (VWF:Ac)
MetodaVWF:RCo
lyofilizované normální promyté trombocyty + ristocetin
využívá antibiotikum ristocetin, který indukuje vazbu
plazmatického VWF na GPIb cílových trombocytů a
jejich aglutinaci
detekce metodou
agregační
turbidimetrickou na koagulačních automatech
 aglutinační
Metoda VWF:RCo
Reagencie
lyofilizované normální promyté trombocyty + ristocetin
Využívá antibiotikum ristocetin, který indukuje
vazbu plazmatického VWF na GPIb cílových
trombocytů a jejich aglutinaci
detekce metodou
agregační
turbidimetrickou na koagulačních automatech
 aglutinační
Metoda VWF:RCo
Agregační metoda
sledování změn transmise světla ve směsi
trombocytů a ristocetinu po přídavku vyšetřované
plazmy (PPP)
vyhodnocení změny transmise/min z agregační křivky
vyjádření výsledku v % odečtením z kalibrační křivky
Turbidimetrická metoda
sledování změn turbidity ve směsi trombocytů a
ristocetinu po přídavku vyšetřované plazmy (PPP)
 vyhodnocení změn absorbance z kinetického měření
 vyjádření výsledku v % odečtením z kalibrační křivky
Metoda VWF:RCo
Aglutinační metoda
sledování aglutinace v suspenzi trombocytů a
ristocetinu po přídavku titrované vyšetřované plazmy
(PPP) na skleněné desce
makroskopické odečtení posledního titru při kterém ještě
nastává aglutinace, vynásobení titru udanou citlivostí
vyjádření výsledku v % semikvantitativně např. >16% a <
32%)
Metoda ristocetin nezávislá
Kvantitativní automatizovaná metoda
 standartizovaná
Princip
vyhodnocení vazby VWF na rekombinantně
připravený GPIb s mutacemi, která
nevyžaduje přítomnost antibiotika ristocetinu
detekce aglutinace latexových částic
metodou imunoturbidimetrickou na koagulačních
automatech
21
Agregace po ristocetinu (RIPA)
Princip
destičkový agregační test v plazmě bohaté na
trombocyty (PRP) pacienta v přítomnosti antibiotika
ristocetinu
použití různých koncentrací ristocetinu
 z důvodu detekce zvýšené citlivosti vWF pacienta na
nízkou koncentraci u typu 2B vWF choroby
Vyhodnocení
maximální amplituda A max (%)
strmost křivky (%/min)
Korekce normální PPP při  RIPA
4 díly PRP pacienta + 1 díl PPP normálu
Testy fibrinolytického systému
Rutinní testy
euglobulinová lýza
trombelastografie
D-Dimery
FDP
Speciální testy (aktivita - fotometricky, antigen - ELISA, EID)
plazminogen ()
a-2-antiplazmin ()
PAI-1()
tPA ()
Diagnostika krvácivých stavů
Screening
poruch primární hemostázy a vWF
v systému koagulačních faktorů
v systému fibrinolýzy
Speciální testy
primární hemostáza
vWF
systém koagulačních faktorů
systém fibrinolýzy
Trombofilní markery
Defekty systémů
 Přirozených inhibitorů krevního srážení
 Koagulačních faktorů
 Fibrinolýzy
 Trombocytů
Přítomnost protilátek
Nespecifických (LA)
Specifických (inhibitor PC, PS, F V, AT..)