Průtoková cytometrie a stanovení lymfocytárních subpopulací Jana Nechvátalová Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně Cluster Designation (Cluster of Differentiation) •buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické molekuly – znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky a její aktivace • •CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen číslem (CD1, CD2, CD3,…). V současné době je na lidských leukocytech charakterizováno asi 400 znaků. • •Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul. Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce. Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech , trombocytech či jiných buněčných populacích. • • B lymfocyty CD19 CD20 CD19 Iga Igb T lymfocyty http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/62/Healthy_Human_T_Cell.jpg/220px-Healthy_Hum an_T_Cell.jpg http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Recognition/Tcel l/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm CD3 na povrchu všech T lymfocytů CD4 na povrchu TH lymfocytů (TH1, TH2) CD8 na povrchu TC lymfocytů Treg – CD4+CD25+ Foxp3+ Monocyty http://ww2.valdosta.edu/~dodrobin/2652/Bloodlab/Mono.JPG CD14 HLA DR -součástí nespecifické imunity -schopnost fagocytózy -tkáňová forma = makrofág NK buňky CD16+ CD56+ CD3- http://immuneresponse.wikispaces.com/file/view/killercell.jpg/228962966/458x323/killercell.jpg NKT buňky CD16+ CD56+ CD3+ Pozn. -rozeznávají buňky, které mají na povrchu abnormálně málo MHC I - nádorové a virově infikované buňky -používají cytotoxické mechanismy (perforin, granzymy) http://www.klinickalaborator.cz/upload/img/image005_2.jpg Pro stanovování lymfocytárních subpopulací odebírat krev do zkumavky s EDTA http://static.medixa.prod.fishcms.cz/media/image/2-lymfocyty.jpg Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 30min inkubace tma pokoj. teplota protřepat Mnoklonální protilátky •protilátky jsou produktem jediného klonu B lymfocytů (klony vzniklé fúzí buněk produkujících protilátky a myelomových buněk, jež schopnost produkce svého vlastního imunoglobulinu ztratily) • •jsou naprosto totožné a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu Beckman Coulter Solastra Five-Color Reagent Panel http://vipdictionary.com/img/255px-Antibody.svg.png http://www.vesmir.cz/files/image/id/581 [tmp798_thumb3.jpg] HAT – Hypoxantin, Aminopterin, Thymidin HGPRT – hypoxantin-guanin-fosforibosyl transferáza TK – thymidinkináza MAb POUŽÍVANÉ K TERAPII •Myší (celé) -momab •Chimérické (myší VH VL ) -ximab •Humanizované (myší hypervar.úseky) -zumab •Lidské (připravené technikami mol.biol. dle knihoven) Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob •Imunosuprese: • - anti-CD3 (OKT3), –anti CD25 (basiliximab, daclizumab), –anti CD20 (rituximab) •Blokáda prozánětlivých cytokinů: –Anti –TNF-a (infliximab, adalimumab) – revmatoidní artritida, Crohnova choroba, •Blokáda adhezivních molekul: –anti integrin a4b1 (natalizumab) – roztroušená mozkomíšní skleróza –Anti-CD11a (efalizumab) - psoriáza •Protialergická léčba –anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu Roztok A: na 1,5 l destilované vody – 1,8 ml 99% kyseliny mravenčí Roztok B: na 1,5 l destilované vody 9,0 g bezvodého Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 Roztok C: na 1,5 l PBS (pH 7-7,4) - 15 g paraformaldehydu LYZOVÁNÍ ERYTROCYTŮ Průtoková cytometrie FLOW CYTOMETRY http://img.medicalexpo.com/images_me/photo-g/flow-cytometer-75322-3239611.jpg Průtokový cytometr 1.FLUIDNÍ SYSTÉM 2.OPTIKA 3.ELEKTRONIKA http://www.cytovas.com/wp-content/uploads/2012/06/cytometer-labels.png 1.FLUIDNÍ SYSTÉM •Zajišťuje transport bb. •v nosné tekutině (pod tlakem) •do průtokové komory. Buňky se •pohybují jedna za druhou • •na základě hydrodynamické fokusace - nosná tekutina •(destil. voda, komerční tekutiny) bývá do komory přinášena tenkou •Kapilárou pod větším tlakem než suspenze částic, které jsou tak •udržovány jen v úzké centrální části proudu. Zrychlení vznikající při •výstupu vodního paprsku z komůrky nutí částice pohybovat se jedna •za druhou. 15µm Velikost buněk: Forward Scatter Přímý rozptyl - úměrný velikosti buňky Granularita buněk: Side Scatter Boční rozptyl – indikátorem vnitřní buněčné struktury (granularity) •2. OPTIKA •Excitační část – laser •Sběrná část – systém čoček, zrcadel a optických filtrů zachycující fluorescenci částic vyzářenou po jejich projití světelným paprskem •3. ELEKTRONIKA •Převádí optické signály (fluorescenci) na signály elektronické (fotonásobiče, fotodiody). •Po zesílení signálu a dalším zpracování dojde k jeho digitalizaci pro počítačovou analýzu Bllod Analysus Flow Cytometry http://healthcare.analog.com/static/imported-files/microsites/healthcare/pop_blood_analysis_fc.html lymfocyty monocyty granulocyty Granularita (SS) •Fluorochromy: -Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty • Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, řada Alexa, řada Pacific and Cascade, • AmCyan, Propidium iodide, 7-AAD, CFSE, -Fluorescenční proteiny • Phycoerythrins (PE), Allophycocyanin, PerCP, • GFP a jiné fluorescenční proteiny • •Schopné absorbovat fotony budícího záření (např. 488 nm) •a následně (10-8 s) emitovat fotony s •delší vlnovou délkou (v tomto případě 500 – 800 nm). •Fluorescenční světlo má tedy jinou barvu Fluorescence Emisní spektrum Absorbční spektrum Vlnová délka (λ) Stokesův posuv Energie (E) Fluorescence E = h.c/l Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii -rozdíl mezi vlnovými délkami emisního a excitačního maxima (nm) Část energie se přemění na energii vibrační CD3 CD4 • • • • • • • CD3 PC5 CD4 PE CD3+CD4+ CD3-CD4- CD3-CD4+ CD3+CD4- CD3 PC5 Krevní diferenciál Monocyty Granulocyty Lymfocyty Zkumavka A CD45/CD3/CD4/CD8 Zkumavka B CD45/CD3/CD19/CD56 + CD16 Vyšetření lymfocytů periferní krve ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu 55-83 CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace 28-57 CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 10-39 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 6-19 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 7-31 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech) Věková závislost zastoupení lymfocytárních subpopulací Comans-Bitter et al. J Pediatr. 1997 Mar;130(3):388-93 Hodnocení nálezu jednotlivých subpopulací Snížení/ zvýšení subpopulace onemocnění ¯ CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii) ¯ CD19+ u některých pacientů s CVID CD19+ B – buněčná leukémie ¯ CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi CD3+ T – buněčná leukémie ¯ CD4+ u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV) CD4+ autoimunity, alergie ¯ CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systematický lupus erythematodes-SLE) CD8+ u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV) Bronchoalveolární laváž (BAL) - imunofenotypizace při převráceném poměru CD4+/CD8+ - podezření na sarkoidózu Pacientka: Ž, *1957 •pacientka z revmatologie - léčba např. rituximabem způsobuje depleci B-lymfocytů (po 4-6 měsících návrat k normálním hladinám) kontrola Pacient: muž, * 1966 kontrola CD5+CD19+ Pacient: M, *1999 převrácený poměr CD8/CD4! CD4+ 13,2% CD8+ 50,9% virová infekce??? (CMV, EBV) CD8+CD38+ 83,2% CD8++CD38++ 92,2% HLA-B27 asociace HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění, jako jsou záněty kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkých kostí rukou, nohou a šlach, dále lupénka (psoriasis), vyrážek, chronické bolesti spodní části zad a spondyloarthropatie, z nichž nejznámější je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění osového skeletu a kloubů - Bechtěrevova nemoc). negativní pozitivní Test aktivace bazofilů (basotest) funkční test umožňující vyšetření aktivace basofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE) - CD203c založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní) - sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů negativní pozitivní Vyšetření fagocytózy PRŮBĚH FAGOCYTÓZY •ADHEZE („rolling“) → cytometrie – defektní exprese leukocytárních integrinů - Leukocyte Adhesion Deficiency Syndromes (LAD1, LAD2) •DIAPEDÉZA = průchod leukocytů cévní stěnou •ROZPOZNÁNÍ OPONIZOVANÝCH ČÁSTIC •CHEMOTAXE → test migrace pod agarózou - ve směru chemotaktického gradientu (chemotaktické faktory, např. IL-8, směřují fagocyty do místa zánětu) •INGESCE → fagocytóza mikroorganismů nebo inertních částic •DIGESCE - mechanismus nezávislý na kyslíku → mikrobicidní test, detekce enzymů - mechanismus závislý na kyslíku → mikrobicidní test, NBT, INT, detekce myeloperoxidázy, chemiluminiscenční test, „burst“ test • Glu-6-P HCO3- HMP zkrat NADP + 2H+ NADPH + H+ NADPH oxidáza O2 O2- + O2- + 2H+ Fe3+ /Fe2+ superoxiddismutáza OH. H2O2 (Haber-Weiss) myeloperoxidáza +SCN- +Cl- +RH HOCl HOSCN + H2O2 + O2- R. + R-NH2 1O2 R-NHCl OH. Vyšetření fagocytózy Burst test •test je využíván ke kvantitativnímu vyhodnocení oxidačního vzplanutí u granulocytů a monocytů v heparinizované plné krvi • •fagocytující buňky se stimulují opsonizovanými E.Coli, fMLP (N-formyl-Met-Leu-Phe) nebo PMA (phorbol-myristát-acetát) • •dochází k oxidačnímu vzplanutí, při kterém se tvoří peroxidy, hydroxylové radikály, superoxidové anionty, které oxidují membránově permeabilní fluorogenní substrát DHR 123 (dihydrorhodamin 123) na zeleně fluoreskující rhodamin 123 • •počet (procento) zeleně fluoreskujících granulocytů a monocytů sledujeme na průtokovém cytometru. Ref. rozmezí: Aktivace pomocí E. Coli u granulocytů: >80% fMLP u granulocytů: <15% PMA u granulocytů: >90% • CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA ZDRAVÁ KONTROLA STIMULACE PMA 97% PACIENT STIMULACE PMA: 12% BEZ STIMULACE STIMULACE PMA ZDRAVÁ KONTROLA PACIENT S CGD STIMULACE E.Coli CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA (AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍ) CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA (X-VÁZANÁ) Vyšetření fagocytózy Myeloperoxidáza - deficit vede ke zvýšené náchylnosti k infekcím Negativní kontrola Vzorek Vyšetření lymfocytárních subpopulací IZOLACE LYMFOCYTŮ •9ml heparinizované krve • •hustotní gradientová centrifugace • (separační medium - lymphoprep) • •rozsuspendováno v RPMI-1640 • s přídavkem 10% fetálního séra • •300ml suspenze + monoklonální protilátky – inkubace • •promytí v PBS a naředění • •měření na průtokovém cytometru plazma, destičky lymfocyty, monocyty granulocyty, erytrocyty SEROLOGICKÉ REAKCE (METODY HUMORÁLNÍ IMUNITY) Mgr. Jana Nechvátalová Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny Klasické serologické reakce Aglutinace – reakce mezi korpuskulárním Ag a Ab s následnou aglutinací částic; proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Ab Precipitace – reakce mezi solubilním Ag (nízkomolekulární) a Ab s následným vznikem precipitátu proběhne 1.+ 2.fáze interakce Ag a Ab Imunoeseje – reakce mezi Ag a Ab vizualizována enzymem, fluorochromem n. radioaktivním zářičem (EIA, RIA n. FIA) ; většinou proběhne jen 1. fáze inter. Ag a Ab Metodiky využívající efektorového účinku Ab: Metodiky s aktivací komplementového systému komplexem Ag – Ab, např. komplement-fixační reakce (KFR) Metodiky s inhibicí biologických účinků některých Ag, např. neutralizační test Aglutinace x precipitace •Aglutinace •Ag + Ab ® Ag-Ab •aglutinogen aglutinin aglutinát •makromolekulární •korpuskulární •nerozpustný • •Protilátky namířené proti epitopům antigenních částic vytváří mezi •korpuskulemi můstky, které vedou ke vzniku shluků – aglutinátů. •jako Ag slouží např. těla bakterií • •Precipitace •Ag + Ab ® Ag-Ab •precipitinogen precipitin precipitát •nízkomolekulární •nekorpuskulární •rozpustný • •Reakce mezi solubilním antigenem a protilátkou s následným vznikem •precipitátu (hydrofobní vazby – nerozpustný komplex). • • Aglutinace Přímá Ag jsou přirozeně součástí povrch. struktur reagujících částic Př. hemaglutinace Nepřímá Zkoumaný Ag navazujeme na povrch částice uměle Př. latex-fixační test – Ag nebo Ab navázaný na latex. částici, pokud dojde k aglutinaci, dokazujeme přítomnost Ab nebo Ag Přímá aglutinace Přirozené protilátky •slouží ke screeningu diagnózy agamaglobulinémie • •tvoří se spontánně, bez záměrné imunizace • •jsou polyreaktivní s nízkou aviditou • •většina patří do isotypu IgM (IgM také nejvíce aglutinuje, je to pentamer) • •normální sérum zdravých jedinců obsahuje přirozené protilátky IgM, IgG a IgA. • •jejich fyziologický význam se předpokládá: • –v časných stádiích infekčních procesů –při regulaci rozvoje autoimunitních chorob –též při odstraňování stárnoucích, fyziologicky degradovaných molekul a buněk • • • Stanovení titru přirozených protilátek •prokazují se aglutinací s králičími erytrocyty, a toto stanovení nám slouží ke screeningu diagnózy agamaglobulinémie. • •ve vyšetřovaném séru je třeba inaktivovat komplement (vodní lázeň…56 oC…30 min.) • •sérum každého pacienta se fyziologickým roztokem následně naředí dvojkovou řadou (1:2 – 1:256) • •z promytých králičích erytrocytů se připraví 0,5 % suspenze (ery + fyziol. roztok), která se přidá do každé zkumavky (1:4 – 1:512) • •všechny zkumavky se nechají inkubovat 2 h při 37 oC v termostatu, a pak přes noc při 4 oC v ledničce • •druhý den se okometricky odečítá hemaglutinace po důkladném protřepání zkumavek • • • určuje se titr protilátek, neboli největší zředění séra, při kterém je aglutinace erytrocytů ještě prokazatelná Latex-fixační test - k průkazu revmatoidního faktoru Revmatoidní faktor (RF) je autoprotilátka namířená proti Fc části IgG molekuly Nepřímá aglutinace • http://images.rheumatology.org/viewphoto.php?imageId=2862312&albumId=75690 Revmatoidní faktor •Autoprotilátka proti Fc fragmentu molekuly IgG • •Přítomen asi u 80% pacientů s revmatoidní artritidou • •Pozitivní je též u asi 5-10% nemocných s jinými systémovými autoimunitními chorobami, autoimunitní hepatitidy, endocarditis lenta • •Může být pozitivní i u zdravých osob • •Diagnosticky nejdůležitější je RF ve třídě IgM 1 Revmatoidní artritis 7 Revmatoidní artritis Precipitace v tekutém prostředí -využívá se efekt, že při reakci Ag-Ab vzniká zákal – precipitát, jehož intenzita je při konstantním množství přidané protilátky úměrná přidané koncentraci vyšetřovaného antigenu • -měření intenzity zákalu – nefelometrie, turbidimetrie • -obě metodiky umožňují kvantitativní stanovení obsahu proteinů ve vzorku odečtem z kalibrační křivky • Nefelometrie a turbidimetrie •reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem •koncentrace příslušného Ag je úměrná rychlosti tvorby zákalu nebo hustotě zákalu •stanovení sérových bílkovin •měření probíhá v tekutém prostředí v měřící kyvetě (pufr, látka urychlující reakci, Ag, Ab) •množství vytvořených komplexů je p.ú.konc. Ag Nefelometrie -hodí se pro nižší koncentrace Turbidimetrie - hodí se pro koncentrovanější roztoky viditelné světlo viditelné světlo detektor je ve směru kolmém na vstupující paprsek měří množství světla rozptýleného při průchodu paprsku (množství světla odraženého od vznikajících komplexů) detektor je v ose paprsku měří množství procházejícího světla (úbytek intenzity světla, které prošlo roztokem v kyvetě) Precipitace v tekutém prostředí: nefelometrie je 5-10x citlivější a nákladnější než turbidimetrie Precipitace v gelu -agaróza, agar -umožňují detekci • precipitačních linií • •- je založena na pasivní difuzi látek v prostředí koncentračního gradientu • • File:Antigen excess.jpg http://www.wikilite.com/wiki/index.php/File:Antigen_excess.jpg - Ag i Ab difundují v prostředí gelu a v místě, kde konc. Ag i Ab dosáhnou optimílního (ekvimolárního) poměru vzniká precipitát Imunodifise I Imunodifuse II Imunodifuse III Radiální imunodifuze •pomocí RID je možno stanovit koncentrace mnohých bílkovinných součástí séra • •metodika se dříve používala při měření hladin celkového IgG, IgA, IgM, složek komplementu nebo různých proteinů akutní fáze - většina těchto vyšetření je však v dnešní době automatizována a provádí se na principu nefelometrie • •v naší laboratoři metodou RID ale stále měříme koncentrace C2, C5 složek komplementu Podle počtu difundujících reaktantů: •jednoduchá radiální imunodifúze -koncetrační gradient jednoho z reaktantů (většinou Ag) -druhý reaktant (většinou Ab) - rovnoměrně rozptýlen ve struktuře gelu -výsledkem jsou ostře ohraničené kroužky precipitátu -plocha prstence – lineární funkcí konc. vyšetřovaného Ag -podle konc. standardu – kalibr. křivka - • • •dvojitá radiální imunodifúze • (podle Ouchterlonyho) -sledujeme antigenní příbuznost antigenů -gradient vytváří jak Ag, tak Ab a dochází k protisměrné difúzi obou reaktantů (radiálně) -v zóně ekvivalence – precipitační linie, která ukazuje na pozitivitu reakce -hodnocení - kvalitativní http://player.slideplayer.cz/9/2566625/data/images/img4.png http://player.slideplayer.cz/9/2566625/data/images/img5.png http://player.slideplayer.cz/9/2566625/data/images/img6.png Komplementfixační reakce (KFR) •sérologická metoda, která slouží nejčastěji k průkazu přítomnosti protilátek • •metoda byla vypracována v roce 1901 Bordetem a Genguem. • •imunologická metoda patřící mezi základní serologické metody, jež fungují na principu reakce protilátky s antigenem, využívá schopnosti komplementu vázat se na komplex antigenu s protilátkou • •využívá se např. k průkazu protilátek proti původcům respiračních infekcí a řady virových onemocnění ; zjištění ochranných protilátek po očkování • •lze použit k identifikaci jak specifických protilátek tak antigenu • •reakce se hodnotí v několika ředěních séra, jako výsledek se udává nejvyšší ředění séra (titr), při kterém ještě nedošlo k hemolýze • •metoda již na ústupu a je často nahrazována jinou technikou (např. ELISA), stále se používá v řadě diagnostických laboratořích například k diagnostice toxoplasmózy • ovčí erytrocyty králičí protilátky proti ovčím ery (=amboceptor) http://www.virion-serion.de/uploads/mit_download/CFT-V9-CZ.pdf morčecí komplement inaktivovat pacientův vlastní komplement! 56°C, 30minut IMUNOESEJE ENZYM RADIOIZOTOP FLUOROCHROM •Kompetitivní -kompetice značeného a neznačeného ligandu o omezený počet vazebných míst protilátek -neznačený antigen blokuje vazbu značeného antigenu, množství vzniklého produktu je nepřímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku -čím víc se naváže značeného ligandu, tím méně neznačeného • •Nekompetitivní -protilátka je v nadbytku, všechen analyt je vyvázán -na navázaný analyt se poté váže sekundární protilátka značená enzymem -množství vzniklého produktu je přímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku • •Homogenní -není potřeba oddělovat Ab-Ag od volného Ag* - •Heterogenní -nutnost separace navázaných složek reakce od volných složek reakce (detekční protilátka, konjugát) http://virus.usal.es/web/demo_microali/enterotoxina/set.html 1. potažení jamek antigenem 2. přidání vzorku séra + inkubace a promytí 3. přídání enzymem značené protilátky + inkubace a promytí 4. přidání substrátu 5. odečtení barevné reakce 1 2 3 4 ELISA Imunoblot kontrolní proužek pozitivní protilátky proti Ag1 pozitivní protilátky proti Ag2 pozitivní protilátky proti Ag3 pozitivní protilátky proti Ag4 C:\Users\Peťula\Desktop\bc\obrázky\Výstřižek.PNG http://www.deviantart.com/download/345357176/out_of_the_way__blood_cells__by_terminaitor-d5pm7aw.pn g