Ionty – Na, K, Cl, Mg, Ca, P, Fe,
mikronutrienty, Pb
Ing. Martina Podborská, Ph.D.
OKB FN Brno
Zpracováno pomocí přednášek RNDr. Miroslavy Beňovské, Ph.D.
Školní rok 2015/2016
 voda
 ionty
 osmolalita
 hlavní fce iontů:
 součást tělesných tekutin,
které jsou rozděleny na:
 Intracelulární (nitrobuněčná):
40% tělesné hmotnosti
 Extracelulární (mimobuněčná):
20% tělesné hmotnosti a dělí se
na:
 Intravazální = krevní plazma
 Intersticiální = mezibuněčná
tekutina
 rozdíly v koncentracích iontů
vně a uvnitř buňky způsobí, že
vnitřní povrch membrány nese
záporný náboj, vnější povrch
pak náboj kladný + vznik
membránového potenciálu
2
Vnitřní prostředí
Převzato z:
https://cs.wikipedia.org/wiki/Membr%C3%A1nov%C3%BD_potenci%C3%A1l
Vnitřní prostředí – koncentrace iontů v tělesných tekutinách
Analyt
Plazma
[mmol/l]
Intersticiální tekutina
[mmol/l]
Intracelulární tekutina
[mmol/l]
Na+ 140 142 10
K+ 4 4 155
Ca2+ 2,5 1,3 < 0,001
Mg2+ 1 0,7 15
Cl- 102 113 8
HCO3
- 24 28 10
Fosfáty 1 1 65
Sulfáty 0,5 0,5 10
Organické kyseliny 4 5 2
3
 hlavní fce:
 udržování normální distribuce vody, osmolality
 udržování osmotického tlaku plazmy
 udržování acidobazické rovnováhy
 reprezentuje 90 % všech kationtů v plazmě
 referenční rozmezí:
 S, P – Na+: 135 – 145 mmol/l
 U – Na+: dospělí 120 – 240 mmol/24h
děti do 1 roku 10 – 30 mmol/24h
 celková zásoba Na+ v těle: 3 700 – 4 000 mmol
 ztráty močí: 120 – 240 mmol/den
4
Sodík - Natrium (Na+)
 regulace koncentrace Na+ v krvi:
 aldosteron: hormon kůry nadlevin, zvyšuje zpětnou reabsorpci
Na+ (a vody) v ledvinách, zvyšuje vylučování K+
 renin-angiotensin: hormony, které regulují uvolnění
aldosteronu; podnětem pro jejich tvorbu je pokles průtoku
krve ledvinami
 antidiuretický hormon (ADH): zvyšuje vstřebávání vody v
ledvinách, podnětem pro jeho tvorbu je zvýšení oslmolality
(nejčastěji zvýšením koncentrace Na+)
 natriuretické peptidy (ANP, BNP): jsou secernovány v srdci,
zvyšují vylučování vody a Na+ v ledvinách
5
Sodík - Natrium (Na+)
 klinické využití:
 hyponatrémie (snížená koncentrace Na+ v krvi):
nadměrná sekrece ADH, nevhodným hrazením ztrát
tekutin infuzemi glukózy, srdeční selhávání,
hypoproteinémie, předávkování diuretik
 hypernatrémie (zvýšená koncentrace Na+ v krvi):
nedostatečný příjem vody, zvýšené ztráty vody (průjmy,
dehydratace), zvýšený přívod Na+ v parentální výživě
6
Sodík - Natrium (Na+)
 hlavní fce:
 úloha v procesu přenosu nervosvalového signálu
 regulace buněčného metabolismu
 regulace sekrece některých hormonů (inzulín, glukagon, aldosteron,
katecholaminy)
 hlavní intracelulární kationt (konc. v erytrocytech je 23x vyšší než v
plazmě; vysoká koncentrace uvnitř buněk je zajištěna pomalou difuzí
přes buněčnou membránu ven)
 ATPasová pumpa transportuje K+ a Na+ do buněk proti
koncentračnímu gradientu
 interference: hemolýza zvyšuje hodnoty draslíku
 referenční rozmezí:
 S, P – K+: 3,8 – 5,1 mmol/l
 U – K+: dospělí 45 – 90 mmol/24h
děti do 1 roku 15 – 40 mmol/24h
 celková zásoba K+ v těle: 3 000 – 4 000 mmol
 ztráty močí: 40 – 90 mmol/den 7
Draslík - Kalium (K+)
 koncentrace K+ v krvi je regulována aldosteronem
 závisí také na hodnotě pH krve:
 při poklesu pH (acidóza): K+ se uvolňuje z fosfátového pufru a přechází z
buněk do extracelulárního prostoru => ↑ konc. K+ v krvi
 při vzestupu pH (alkalóza): K+ se v buňkách váže na fosfátový pufr, přechází
z extracelulární tekutiny do buněk => ↓ konc. K+ v krvi
 klinické využití:
 hypokalémie: snížená hladina K+; příčinou je přesun K+ do
buněk (alkalóza, infuze glukózy s inzulinem, zvýšené ztráty K+
ledvinami
 hyperkalémie: zvýšená hladina K+; příčinou je přesun K+ z
buněk do krve (acidóza, katabolismus, hemolýza), neschopnost
vyloučit K+ ledvinami (renální selhání)
8
Draslík - Kalium (K+)
 klinické důsledky hypo a hyperkalémie:
 větší změny koncentrace K+ v krvi mohou mít vážné důsledky,
protože ovlivňují nervosvalovou dráždivost
 velmi nízké konc. K+ vedou ke svalovým křečím, poruchám
srdečního rytmu, zástavě činnosti střev (ileus), svalové
slabosti a poruchám až k zástavě dechu
 konc K+ ˃ 6,5 mmol/l mohou nastat poruchy srdečního rytmu
a při hodnotách 9 mmol/l dochází k zástavě srdeční činnosti
 pseudohyperkalémie: ↑ konc. K+ stanovená „ve zkumavce“, pacient má
však konc. K+ normální => je to způsobeno únikem K+ z krevních elementů
do séra nebo plazmy, v odběrové zkumavce při hemolýze nebo při dlouhé
době od odběru krve do oddělení séra (plazmy) od krevních elementů
9
Draslík - Kalium (K+)
 hlavní fce:
 společně s hydrogenuhličitany (HCO3
-) jsou hlavním
aniontem v extracelulární tekutině
 udržují osmolalitu
 mají rozhodující vliv na acidobazickou rovnováhu
 referenční rozmezí:
 S, P – Cl-: 97 – 105 mmol/l
 U – Cl-: dospělí 120 – 240 mmol/24h
děti do 1 roku 3 – 10 mmol/24h
 pot – Cl-: 10 – 30 mmol/l
 celková zásoba Cl- v těle: 2 400 mmol
 ztráty močí: 120 – 240 mmol/den 10
Chloridy (Cl-)
 klinické využití:
 výchylka v konc. Cl- vede většinou ke změně v konc.
hydrogenuhličitanů tak, aby součet Cl- a HCO3
- iontů zůstal
konstantní :
 zvýšení konc. Cl- : ↓ konc. HCO3
- v krvi =˃ metabolická acidóza
 pokles konc. Cl-: ↑ konc. HCO3
- v krvi =˃ metabolická alkalóza
 hypochlorémie: ztráta Cl- zvracením, podáváním diuretik
 hyperchlorémie: zvýšený příjem anebo omezené vylučování
Cl- ledvinami
11
Chloridy (Cl-)
12
Vápník - Kalcium (Ca2+)
 hlavní fce:
 má zásadní význam pro vedení nervového vzruchu, nervosvalovou
dráždivost, sílu svalového stahu
 vylučování řady hormonů
 krevní srážlivost
 tvorbu kostní hmoty
 laktaci
 referenční rozmezí:
 S, P – Ca2+ celkové: 2,25 – 2,75 mmol/l
 Ionizované Ca2+: 1,15 – 1,32 mmol/l
 celková zásoba Ca2+ v těle: 30 000 mmol (1,2 kg)
 z toho 99 % v kostní hmotě ve formě hydroxyapatitu, pouze 1% je k
dispozici jako volně Ca2+ směnitelné
 ztráty močí: 0,9 – 5,5 mmol/den
 klinické využití:
 hypokalcémie: může být způsobena nedostatkem vit. D,
hypoparathyreozóu, nedostatečným příjmem Ca v potravě,
hypoproteinémií
 hyperkalcémie: přesun Ca2+ z kostí do krve (hyperparathyreóza,
rozpad kostní hmoty)
 klinické důsledky hypo a hyperkalcémie:
 velmi nízké konc. ionizovaného Ca2+ svalovými křečemi
 vysoké konc. Ca2+ se projevují únavou, svalovou slabostí, při
těžké hyperkalcémii hrozí i zástava srdce
13
Vápník - Kalcium (Ca2+)
14
Hořčík - Magnezium (Mg2+)
 hlavní fce:
 ovlivňuje nervosvalovou dráždivost (stabilizuje buněčné membrány)
 má klíčovou úlohu jako kofaktor mnoha enzymů vč. těch, které zajišťují
energetický metabolismus (cukrů, tuků, bílkovin, NK)
 je nezbytný pro syntézu bílkovin, pro tvorbu kostní hmoty, v procesu
srážlivosti
 v moči brání tvorbě konkrementů
 referenční rozmezí:
 S, P – Mg2+: 0,8 – 1,1 mmol/l
 U – Mg2+: 1,7 – 8,2 mmol/24h
 Ionizovaný Mg2+: 0,4 – 0,65 mmol/l (krev)
 celková zásoba Mg2+ v těle: 1 000 mmol (24 g)
 z toho v kostech asi 65 % a ve svalech asi 20 %; jen 2 % v extracelulární a
intracelulární tekutině
 v krvi je 55% je „volný“ – ionizovaný Mg2+; 30 % je vázáno na bílkoviny
(albumin), 15% se vyskytuje ve formě komplexních sloučenin (citrát, fosfát, atd.)
 ztráty močí: 1,7 – 8,2 mmol/den
 klinické využití:
 hypomagnezémie: může být způsobena alkalózou,
zvýšenou ztrátou Mg2+ ledvinami, nedostatečný příjem
 hypermagnezémie: příčinou může být selhání ledvin,
acidóza
 klinické důsledky hypo a hypermagnezémie:
 velmi nízké konc. Mg2+ vedou k tetanii a ke svalovým křečím,
poruchám srdečního rytmu
 vysoké konc. Mg2+ vedou ke svalovým slabostem, ke zvracení,
k poruchám srdečního rytmu
15
Hořčík – Magnezium (Mg2+)
16
Jaké jsou doporučené metody?
Analyt
Doporučené rutinní
metody
Referenční
metoda
Certifikovaný
referenční
materiál
Na+, K+, Cl•
ISE moduly (přímá a
nepřímá potenciometrie)
• FAES (s Li nebo Cs vnitřní
standard
• ID-MS
• FAES
• IC (navržená)
• SRM 909b NIST
• SRM 956a
• NIST/SRM 912a USA
Ca2+
• spektrofotometrické
metody
• FAAS
• FAES
• ISE metoda bez ředění
• ID-MS
• FAAS
• IC (navržená)
• SRM 909b NIST
• SRM 956a
• NIST/SRM 915a USA
(pouze sérum)
• BCR/CRM 303, 304
(pouze sérum)
• SRM 956b (pouze
plná krev)
Mg2+
• spektrofotometrické
metody
• FAAS
• FAAS
• IC (navržená)
• SRM 909b NIST
• SRM 956a
• BCR/CRM 303, 304
(pouze sérum)
• NIST/SRM 929 USA
(pouze sérum)
17
Natrium, Kalium, Chloridy (S,P,U) – metody stanovení
1. Doporučená rutinní metoda – ISE modul:
 jedná se o nepřímou potenciometrii s ředěním
 používá průtočné iontově selektivní elektrody (ISE) pro Na, K, Cl a
referenční argentchloridovou elektrodu
 společné stanovení
 měří se rozdíl potenciálu mezi IS elektrodou a referenční elektrodou
 IS elektroda měří aktivitu, přepočet na koncentraci pomocí
aktivitního koeficientu
 stanovení: nepřímá nebo přímá potenciometrie
 u naředěných vzorků se po dosažení rovnovážného stavu měří
elektromotorická síla
 míchání je zajištěno pomocí ultrazvuku
 výkon ISE modulu (2 měřící jednotky) je až 1 800 testů/h
18
 nepřímá potenciometrie:
 historicky starší je metoda nepřímá
 u této metody se analyzuje vzorek značně naředěný (např. 30x)
diluentem o vysoké iontové síle
 generovaný elektrický potenciál je porovnáván a potenciálem
standardních roztoků, čímž je zabráněno výkyvům vlivem teploty
nebo elektrické nestabilitě
 koncentrace iontů se počítá podle Nerstovy rovnice
 výsledky odpovídají měření plamenovou emisní
spektrofotometrií
 chyba způsobená přítomností proteinů a lipidů v plazmě (7%)
 naměřené hodnoty se počítají na celkový objem plazmy
 např. koncentrace 145 mmol Na+/l bude ve vodné fázi
(počítáme-li 93% vodné fáze) ve skutečnosti 156 mmol Na+/l
 negativní chyba známa po řadu let
Natrium, Kalium, Chloridy (S,P,U) – metody stanovení
19
 nepřímá potenciometrie:
 u vzorků moče se koncentrace Na+, K+, Cl- stanovují vždy
po naředění diluentem s vyšší iontovou silou
 přímá potenciometrie:
 objevila se s miniaturizací elektrod
 měří se neředěný vzorek
 neprosadila se
Natrium, Kalium, Chloridy (S,P,U) – metody stanovení
20
ISE elektrody:
 jednotlivé ISE elektrody
 elektrody integrované do jednoho modulu - tzv.
„integrovaná chipová technologie“
 většina elektrod je na bázi tenkovrstvé ionoforové
technologie (ionofory = látky, které umožňují
transport iontů přes membránu)
 makrocyklické ionofory - molekuly s dutinami, ve
kterých jsou pevně vázány ionty př. „crown etery“
Natrium, Kalium, Chloridy (S,P,U) – metody stanovení
21
Natrium (S,P,U) – metody stanovení
1. Doporučené rutinní metody:
1.1 Metoda ISE bez ředění
1.2. Metoda ISE s ředěním
1.3 Plamenová emisní fotometrie (FAES s Li n. Cs):
 excitované atomy Na+ emitují spektrum s ostrou čarou při 768 nm
 tato metoda společně s K+ byla v laboratořích velmi běžná, ale nyní
se již rutinně nepoužívá
1.4 Spektrofotometrická metoda - enzymatická:
 je založena na aktivaci enzymu b-galaktosidázy ionty Na+ a na hydrolýze
chromogenního substrátu 2-nitro-b-D-galaktopyranosidu na galaktózu a
2-nitrofenol
 rychlost hydrolýzy se měří kineticky při 420 nm
 rutinně se ale již nepoužívá
22
Kalium (S,P,U) – metody stanovení
1. Doporučené rutinní metody:
1.1 Metoda ISE bez ředění
1.2. Metoda ISE s ředěním
1.3 Plamenová emisní fotometrie (FAES s Li
spektrálním pufrem):
 excitované atomy K+ emitují spektrum s ostrou čarou při 589 nm
 tato metoda společně s Na+ byla v laboratořích velmi běžná, ale
nyní se již rutinně nepoužívá
1.4 Spektrofotometrická metoda - enzymatická:
 je založena na aktivaci vhodného enzymu ionty K+
 např. stanovení pomocí tryptofanpyrolázy se substrátem tryptofanem
 metoda není doporučena
23
Chloridy (S,P,U) – metody stanovení
1. Doporučené rutinní metody:
1.1 Metoda ISE bez ředění
1.2. Metoda ISE s ředěním
1.3 Coulometrie
 stanovení je založeno na generaci Ag+ ze stříbrné anody konstantní
rychlostí
 ionty Ag+ reagují s Cl- za vzniku nerozpustného AgCl
 při dosažení bodu ekvivalence se generace Ag+ zastaví
 obsah Cl- je přímo úměrný času, který se měří
 rutinně se nepoužívá
1.4 Spektrofotometrická metoda - enzymatická:
 je založena na reakci: 2 Cl- + Hg (SCN)2 HgCl2 + 2 SCN-
3 SCN- + Fe3+  Fe (SCN)3
 vzniklý produkt červeného thiokyanatanu železitého se pak měří
fotometricky
24
Celkový vápník (S,P) – metody stanovení
Doporučené rutinní metody:
1. Spektrofotometrické:
1.1 Stanovení s o-kresolftaleinkomplexem
1.2 Stanovení s arsenazo III
1.3 Stanovení s NM-BAPTA
2. Plamenová atomová absorpční spektrofotometrie (FAAS)
3. Plamenová atomová emisní spektrofotometrie (FAES)
4. Metoda ISE bez ředění
5. Volné ionizované kalcium
25
Celkový vápník (S,P) – metody stanovení
1. Spektrofotometrické:
1.1 Stanovení s o-kresolftaleinkomplexem
 při pH 12 reagují Ca2+ s o-kresolftaleinkomplexem za vzniku
stabilního purpurového komplexu s absorpčním maximem při
600 nm
 Mg2+ je maskováno pomocí 8-hydroxychinolinu
 metoda je citlivá na vzdušný CO2
 nejvíce používaná metoda
1.2 Stanovení s arsenazo III
 v imidazolovém pufru při pH 6 tvoří Ca2+ s arsenazo III modrý
komplex, který se stanovuje fotometricky
 při daném pH má činidlo specifickou afinitu k vápníku
 dražší, ale analyticky spolehlivější metoda
26
Celkový vápník (S,P) – metody stanovení
1. Spektrofotometrické:
1.3 Stanovení s NM-BAPTA
 vápenaté ionty + 5-nitro-5’-metyl-BAPTA (pH 10)
komplex Ca-NM-BAPTA – ten reaguje s EDTA (pH 7,3)
komplex NM-BAPTA + Ca-EDTA
 úbytek absorbance při 600 nm je úměrný koncentraci vápníku
 nová vysoce stabilní metoda Roche
27
Celkový vápník (S,P) – metody stanovení
2. Plamenová atomová absorpční spektrofotometrie
(FAAS)
 stanovovaný vzorek se naředí 1:50 roztokem HClO4 s přídavkem
chloridu lantanitého nebo strontnatého
 analýza je v plameni acetylén-vzduch s Ca-lampou
 naředění podpoří disociaci z organických a anorganických
sloučenin => uvolnění z fosfátů, snížení viskozity
 stanovení se běžně neprovádí
 avšak pro stanovení Ca2+ v moči/24h je tato metoda specifičtější
než fotometrické metody na analyzátorech, neboť umožňuje
vzorek předem okyselit s HCl a rozpustit tak krystaly solí (pro
stanovení souboru litiázy)
28
Celkový vápník (S,P) – metody stanovení
3. Plamenová atomová emisní spektrofotometrie (FAES)
 pro excitaci atomů Ca se využívá budící zdroj plamene acetylenvzduch
=˃ zajistí potřebnou vyšší teplotu než zdroj propan-
vzduch
 AES – emisní spektrum  Atomový emisní spektrofotometr
29
5. Volné ionizované kalcium (B) – metody stanovení
 stanovení pomocí ISE elektrody v plné krvi (odebrané do
heparinizovaných zkumavek či kapilár) na speciálním přístroji
nebo na přístroji pro ABR stanovení
 měří se rozdíl potenciálu mezi vápníkovou ISE elektrodou, resp.
pH elektrodou a referenční elektrodou
 vydává se výsledek naměřený i výsledek přepočítaný na pH 7,4
 ISE elektroda měří aktivitu, která je přepočítána na koncentraci
pomocí aktivitního koeficientu
 proto musí mít kalibrátory stejnou iontovou sílu jako měřené
vzorky (především stejnou koncentraci Na+ a Cl- iontů)
30
Celkové magnezium (S,P) – metody stanovení
Doporučené rutinní metody:
1. Spektrofotometrické:
1.1 Stanovení s xylidylovou modří (magon)
1.2 Stanovení s arsenazo III
1.3 Stanovení s Chlorphfosphonazo III
1.4 Stanovení s calmagitem
2. Plamenová atomová absorpční spektrofotometrie (FAAS)
3. Volné ionizované magnezium
31
Celkové magnezium (S,P) – metody stanovení
1. Spektrofotometrické:
1.1 Stanovení s xylidylovou modří (magon)
 Mg2+ + xylidylová modř v alkalickém prostředí
 vznik purpurové diazoniové soli s absorpčním maximem 600 nm
 ionty Ca2+ maskovány s EGTA (kyselina etylen glykol –
bis(aminoetyl) tertraoctová)
1.2 Stanovení s arsenazo III
 ionty Mg2+ reagují v alkalickém prostředí s chromogenem
arzenazo III
 vznik fialového komplexu s absorpčním maximem při 570 nm
 interferenci vápníku je zabráněno specifickým komplexotvorným
činidlem
32
Celkové magnezium (S,P) – metody stanovení
1. Spektrofotometrické:
1.3 Stanovení s Chlorphfosphonazo III
 Chlorophosphonazo III (CPZ III) v neutrálním prostředí reaguje s
ionty Mg2+ za vzniku komplexu Mg-CPZ III
 interferenci Ca 2+ zabraňuje EGTA (ethylen
bis(oxyethylennitrilo)tetra-octová kyselina), která inhibuje vazbu
vápníku na CPZ III
 již se nepoužívá
1.4 Stanovení s calmagitem
 fotometrické stanovení se provádí rovněž v alkalickém prostředí
při 520 nm
 kalcium může být maskováno s EGTA
33
Celkové magnezium (S,P) – metody stanovení
2. Plamenová atomová absorpční spektrofotometrie
(FAAS)
 stanovovaný vzorek se naředí 1:50 roztokem HClO4 s přídavkem
chloridu lantanitého nebo strontnatého
 analýza je v plameni acetylén-vzduch
 naředění podpoří disociaci z organických a anorganických
sloučenin => uvolnění iontů Mg2+ z komplexů s fosfáty a
proteiny, snížení viskozity
 v laboratořích klinické biochemie se stanovení běžně neprovádí
34
3. Volné ionizované magnezium (B) – metody stanovení
 stanovení pomocí ISE elektrody v plné krvi (odebrané do
heparinizovaných zkumavek či kapilár) na speciálním přístroji
nebo na přístroji pro ABR stanovení (Nova Biomedical)
 krátká životnost (1 měsíc) elektrod, nízká frekvence
požadovaných stanovení => finanční náročnost
35
Fosfor anorganický (P) / fosfáty
 hlavní fce:
 udržování acidobazické rovnováhy v buňkách (fosfátový pufr a v
ledvinách
 energetický metabolismus – fosforylace živin pro jejich zpracování
 zásobní forma energie (ATP)
 referenční rozmezí:
 S, P – fosfáty: dospělí 0,7 – 1,6 mmol/l
děti 1-2 roky 1,5 – 2,2 mmol/l
 U – fosfáty: 25 – 50 mmol/24h
 celková zásoba fosfátů v těle: 20 000 – 25 000 mmol (600-
800 g)
 většina je uložena v kostech ve formě hydroxyapatitu, zbytek je většinou v
intracelulární tekutině
 ztráty močí: 25 – 50 mmol/den
 klinické využití:
 hypofosfatémie: bývá při hyperparathyreóze, hypovitaminóze D,
při onemocnění střeva (porucha vstřebávání), alkoholismus
 hyperfosfatémie: je fyziologická v době růstu, dále ji způsobuje
selhání ledvin, hypoparathyreóza či předávkování vitamínu D
 forma a přítomnost fosfátů v těle:
 fosfáty existují v séru jako monovalentní a divalentní anionty
 poměr H2PO4
-/HPO4
- je při pH 7,1 1:4
 10% fosfátů je vázáno na protein, 35% tvoří kompexy s natriem,
kalciem a magnesiem a zbývajících 55% je volných
 v krvi jsou přítomny anorganické i organické fosfáty, ale běžně se v
klinické biochemii stanovuje anorganický fosfor
 organické estery jsou lokalizovány především v buněčných
elementech 36
Fosfor anorganický (P) / fosfáty
37
Železo (Fe)
 hlavní fce:
 je nezbytné pro funkci buněk; je jedním z nejdůležitějším prvků
v lidském těle
 jako součást hemu se účastní transportu kyslíku
 jako součást cytochromů podmiňuje přenos elektronů v
dýchacím řetězci
 referenční rozmezí:
 S, P – Fe: muži 10,6 – 28,3 mmol/l
ženy 6,6 – 26,0 mmol/l
 U – Fe: < 1,8 mmol/24h
 celková zásoba fosfátů v těle: 70 mmol (4-4,5 g)
38
Železo (Fe)
 Distribuce Fe v organismu:
Forma Funkce Protein
Množství
(g)
Aktivní Fe
transport kyslíku
hemoglobin 2,5 – 3,0
myoglobin 0,3
přenos elektronů
cytochromy,
cytochromoxidáza
0,2
rozklad H2O2
kataláza,
peroxidáza
Zásobní Fe zásoba Fe
ferritin,
hemosiderin
0,8 – 1,0
Transportní Fe transport Fe transferin 0,003
39
Železo (Fe)
 forma a přítomnost Fe v těle:
 Fe3+ vázáno na transportní b-1-globulin nazývaný
apotransferin
 stanovované koncentrace železa v séru odpovídá Fe3+
vázanému v sérovém transferinu, nezahrnuje železo
obsažené v séru jako volný hemoglobin
 běžně Fe3+ obsazuje pouze jednu třetinu vazebných míst
v transferinu
 poměr navázané části Fe se nazývá saturace transferinu
 nedostatek Fe: způsoben jeho nedostatečným vstřebáváním ze
střeva nebo chronickými ztrátami krve =˃ sideropenie = ˃ může
vyústit až v sideropenickou anémii
 nadbytek Fe: organismus není vybaven exkreční cestou pro
železo, proto se za určitých okolností může přebytečné železo
hromadit ve tkáních (může dojít k poškození tkání) = ˃
 hemochromatóza: dědičné onemocnění způsobené zvýšenou
resorpcí železa ze střeva
 přebytečné železo se ukládá v parenchymatózních orgánech jako jsou
játra, srdce, pankreas, nadledviny
 v postižených orgánech působí toxicky a narušuje jejich funkci tím, že
může katalyzovat chronické reakce vedoucí k tvorbě volných radikálů
 hlavními klinickými projevy jsou hyperpigmentace kůže,
hepatosplenomegalie a diabetes mellitus
40
Železo (Fe) – klinické využití
41
Jaké jsou doporučené metody?
Analyt
Doporučené rutinní
metody
Referenční
metoda
Certifikovaný
referenční
materiál
P • UV molybdátová metoda
• neexistuje
• navrhovaná
ID-MS, IC
• DGKCH
Fe3+ • spektrofotometrická
metoda s ferrozinem
• neexistuje • NIST/SRM 937 USA
Pb2+
(nepatří do
mikronutrientů)
• ET-AAS
42
Fosfor (S,P, U) – metody stanovení
Doporučené rutinní metody:
1. UV – molybdátové metody
1.1 Stanovení s molybdenanem amonným
1.2 Stanovení s molybdenanem a vanadičnanem amonným
1.1 Stanovení s molybdenanem amonným
 v prostředí H2SO4 vznik fosfomolybdátového komplexu
(NH4)3[PO4(MoO3)12]
 detekce při 340 nm (UV oblast)
 nebo následná reakce fosfomolybdátového komplexu
s redukčním činidlem (kyselina aminonaftolsulfonová – nízká
stabilita) => fosfomolybdenová modř (stanovení absorbance
při 650 nm)
43
Fosfor (S,P, U) – metody stanovení
Doporučené rutinní metody:
1. UV – molybdátové metody
1.2 Stanovení s molybdenanem a vanadičnanem
amonným
 v kyselé prostředí vznik žluté kyseliny
molybdátovanadátofosforečné
 analýza se provádí po deproteinizaci supernatantu
 jinak dochází k nadhodnocení anorganického fosforu, neboť
při reakci dochází k hydrolýze organických esterů
 metoda není vhodná k automatizaci
44
Železo (S,P, U) – metody stanovení
Doporučené rutinní metody:
1. Spektrofotometrické metody s ferrozinem (S, P)
 Fe se stanovuje po uvolnění z transferinu a po redukci na Fe2+
reakcí se skupinou –N=CH-HC=N
dochází k tvorbě barevných komplexů, které se stanovují
fotometricky
1.1 Stanovení s ferrozinem
1.2 Stanovení s bathofenantrolinem
 vzhledem k nízké koncentraci Fe v moči nejsou pro tento materiál
vhodné spektrofotometrické metody a používá se AAS
45
Železo (S,P) – metody stanovení
Doporučené rutinní metody:
1. Spektrofotometrické metody s ferrozinem
1.1 Stanovení s ferrozinem
 Fe3+ se uvolní z komplexu s transferinem přidáním
citrátového pufru (pH<2)
 Fe3+ je redukováno kyselinou askorbovou na Fe2+
 Fe2+ tvoří s ferrozinem modrý komplex, jehož absorpční
maximum je při 570 nm
1.2 Stanovení s bathofenantrolinem
 v minulosti nejčastěji používána
 není však vhodná pro automatizaci
 Vzorek je deproteinizován a Fe3+ po přídavku kyseliny
thioglykolové redukuje na Fe2+
 s bathofenantrolinem pak dává Fe2+ červený komplex, který
je fotometricky stanoven
46
Celková a volná vazebná kapacita železa
 Stanovení celkové vazebné kapacity železa (TIBC = Total Iron
Binding Capacity)
 je metoda, která je založena na přídavku nadbytku roztoku FeCl3
 po vysycení transferinu se přidá pevný MgCO3
 směs se promíchá, po 30 min odstředí a přebytečné Fe3+ se oddělí ve sraženině
 v supernatantu se pak stanoví koncentrace Fe3+, která odpovídá TIBC stanovené
fotometricky
 v současnosti minimální použití, nelze automatizovat
 Stanovení volné vazebné kapacity železa
 v přítomnosti trisového pufru je k séru přidána známí koncetrace Fe2+ v nadbytku
 ty se specificky vážou n atransferin
 nezreagované železnaté ionty jsou pak stanoveny s ferrozinem
 rozdíl mezi koncentrací původně přidaných Fe2+ a stanovenou koncentrací Fe2+
odpovídá volné vazebné kapacitě
 celková vazebná kapacita se pak vypočítá jako součet volné vazebné kapacity a
koncentrace sérového železa
47
Celková a volná vazebná kapacita železa
 Celková vazebná kapacita železa (TIBC = Total Iron Binding
Capacity) je také metoda, která se využívá k výpočtu saturace
transferinu:
konc. Fe v séru
Saturace transferinu (%) = ---------------------- x 100
konc. TIBC
 referenční rozmezí (S,P): 45 - 75 mmol/l
 Výpočet saturace transferinu vypočtené z koncentrace transferinu
stanoveného imunoturbidimetricky ze séra:
konc. Fe (mmol/l) v séru
Saturace transferinu (%) = ----------------------------------- x 3,98 x 100
konc. transferinu (g/l)
 referenční rozmezí saturace transferinu: M 0,21 - 0,40
Ž 0,20 – 0,36
48
Stopové prvky – mikronutrienty (Zn, Cu, Se)
 v organismu se vyskytují ve velmi nízkých koncentracích
 nutnost dostatečně citlivých metod
 v preanalytické fázi zabránit kontaminaci biologického vzorku
 v analytické (příprava vzorku, kalibračních roztoků) fázi použití
velmi čistých chemikálií (Suprapur) a dokonale deionizované H2O
 referenční metoda: Neutronová aktivační analýza (NAA)
 doporučenou metodou v klinické biochemii je:
 Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) - s plamenovou (FAAS)
- elektrotermickou atomizací
(ET-AAS)
 Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-
AES)
49
Stopový
prvek
Analyzovaný
materiál
Stabilita
Speciální
preanalytické
požadavky
Referenční rozmezí
Zn S, P, U
S 2 týdny
(+4oC)
1 rok (-20oC)
zabránit kontaktu s
gumou (obecná
pravidla pro
stopovou analýzu)
S, P 9,5 – 19,0 mmol/l
dU 3,0 – 9,0 mmol/24h
Cu S, P, U
S 2 týdny
(+4oC)
1 rok (-20oC)
obecná pravidla
pro stopovou
analýzu
S, P M 11,0 – 22,0 mmol
Ž 12,5 – 24,0 mmol
dU 0,2 – 0,9 mmol/24h
Se
S, P, B
S 2 týdny
(+4oC)
1 rok (-20oC)
obecná pravidla
pro stopovou
analýzu
S, P 0,8 – 1,2 mmol
dU 0,1 – 0,4 mmol/24h
Stopové prvky – mikronutrienty (Zn, Cu, Se)
50
Stopové prvky (Zn, Cu, Se) – metody stanovení
 doporučenou metodou v klinické biochemii je:
 Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) - s plamenovou
(FAAS):
o využívá se absorpce monochromatického záření vysílaného výbojkou vyzařující
spektrální čáry daného prvku
o aerosol vzorku je atomizován v plameni při 1 200 – 2 800oC
o kapalný vzorek je nasáván přes zmlžovač a zmlžovací komoru do plamene, kde
dochází k vypaření aerosolu vzorku, spálení organických součástí (mineralizace) a
rozložení sloučenin na atomy v základním stavu (atomizace)
o k potlačení nežádoucí ionizace se dociluje přídavkem solí alkalických kovů
 Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) - elektrotermickou
atomizací (ET-AAS):
o princip této metody je stejný jako u FAAS, rozdíl je ve způsobu atomizace =˃ plamen
je nahrazen atomizérem, elektricky vyhřívanou píckou (kyvetou - nejčastěji z grafitu)
s naprogramovaným teplotním režimem – kontrola teploty a času
o metoda dosahuje velmi nízkých mezí detekce
51
Stopové prvky (Zn, Cu, Se) – metody stanovení
 doporučenou metodou v klinické biochemii je:
 Atomová emisní spektrometrie s indukčně vázaným
plazmatem (ICP-AES):
o principem je sledování emitovaného záření výboje ICP (indukovaně
vázaná plazma) po jeho disperzi na mřížce spektrometru
o ICP výboj vzniká v proudu argonu při atmosférickém tlaku, vzniká
po iniciaci plynu (Ar) – ten protéká křemennou plazmovou hlavicí
v kruhové indukční cívce, kde protéká vysokofrekvenční proud a vzniká
elektromagnetické pole
o plazmový výboj dosahuje teplot 5 000° - 10 000 ° K => dochází snadno
k vypaření aerosolu vzorku, disociaci, atomizaci a excitaci atomů prvků
o čarovou emisí excitovaných atomů a iontů je tvořeno záření
o záření je monochromatizováno v mřížkovém spektrálním přístroji a
detekováno
o multiprvková analýza
52
Olovo (Pb)
 patří do těžkých kovů, nepatří mezi mikronutrienty
 je toxický pro lidský organismus
 vyšší obsah Pb v organismu ovlivňuje i krvetvorbu způsobuje zvýšení kyseliny daminolevulové
a koproporfyrinů v moči (saturnismus – chronická otrava Pb)
 za normálních okolností se Pb vyskytuje v organismu jen v malých
koncentracích, uvádí se proto dvě hladiny:
 nízká normální hladina u neexponované populace
 nejvyšší přípustný limit tj. koncentrace při které ještě nedochází k významnému poškození
organismu
 metoda stanovení v nesrážlivé krvi (odběrová zkumavka s EDTA):
 Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) - elektrotermickou
atomizací (ET-AAS):
o stanovení Pb se provádí metodou ETA-AAS v grafitové kyvetě se Zeemanovou korekcí
pozadí
o atomy Pb absorbují záření o vlnové délce 283,3 nm
o úbytek záření je úměrný koncentraci Pb ve vzorku