Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 3: Fyziologie bakterií, kultivační půdy Ondřej Zahradníček zahradnicek@fnusa.cz Nejprve opakování z minula Morfologie bakterií (složení, tvary, uspořádání, sporulace) Fyziologie bakterií (množení, metabolismus, využívání substrátů) Barvení (= pozorování mikroba jako morfologické jednotky) Kultivace (= pozorování růstových, tedy fyziologických vlastností mikroba Množení bakterií (u bakterií je synonymem i slovo „růst“) nMnožení bakterií je základním projevem jejich životaschopnosti nKaždá bakterie má svou generační dobu (zpravidla hodiny, u některých dny) nZa jednu generační dobu jsou z jedné dvě, za desetinásobek je z jedné 1024 bakterií (teoreticky) a podobně nIdeální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali odpadní produkty big_22248 pristroje3 Reálná růstová křivka nFáze lagu– bakterie jsme nechali kultivovat, ale ještě jich nepřibývá nFáze exponenciální – růst se zrychluje nFáze stacionární – rostou pořád stejně rychle nZpomalení a zastavení růstu – došly živiny, je příliš mnoho odpadů, nebo bakterie samy regulují svůj počet pomocí „quorum sensingu“ Růstová křivka bakterií v uzavřeném systému 400px-R%C5%AFstov%C3%A1_k%C5%99ivka 1 Lag fáze 2 logaritmická (exponenciální) fáze 3 stacionární fáze 4 fáze odumírání Fyziologie bakterií nTak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus nKatabolismus může být trojí: nFermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík nAerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík nAnaerobní respirace – není nutný kyslík, ale je nutný jiný akceptor elektronů (například síra); málo významné u klinicky významných bakterií Vztah bakterií ke kyslíku nAerobní a fakultativně anaerobní (případně také aerotolerantní) bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry nStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku nBakterie se speciálními nároky na kyslík vyžadují speciální atmosféru (mikroaerofilní a kapnofilní bakterie) Jak spolu souvisí katabolismus a vztah ke kyslíku? nTyp katabolismu je úzce spjat se vztahem ke kyslíku. nFermentující bakterie jsou zpravidla fakultativně či striktně anaerobní. n(Pravé fakultativně anaerobní bakterie umějí „přepínat“ fermentaci na aerobní respiraci; ty, které to neumějí, pouze fermentují a přesto kyslík snášejí, se správně nazývají aerotolerantní. V praxi se často obě skupiny nerozlišují.) nNaopak aerobně respirující bakterie bývají striktně aerobní. nExistují ovšem i výjimky Substráty nFermentovat i respiračně odbourávat lze různé substráty. Substrátem může být polysacharid, monosacharid, aminokyselina, lipid apod. nPro různé bakterie existují typické substráty, které umějí buďto fermentovat nebo respiračně odbourávat. To se využívá v diagnostice. nTypické substráty zpravidla souvisejí s adaptací mikrobů na určité prostředí nebo s tím, jaké produkty či třeba jaké pH bakterie potřebují ke svému životu. Co chutná… třeba takové salmonelce nManit? Mňam! nSacharóza? Fuj! C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\2003 02 Enterobaktérie\SAEN_ŠVE_Martínek.jpg C:\Uživatel\Ondra\Mimopracovní aktivity\Díla a dílka\Literární a podobné akce\Noc vědců\Detektiv samotný.bmp Příklad – ureázová aktivita helikobaktektera Ureáza Urea (močovina) se v žaludku vyskytuje, a její štěpení helikobakterům umožňuje zvýšit ve svém těsném okolí pH a vzdorovat tak žaludeční kyselině Mikrobiologické metody – rozdělení (opakování) nMetody přímého průkazu nPřímý průkaz ve vzorku (pracujeme s celým vzorkem, například sputem, mozkomíšním mokem, močí apod.) nIdentifikace kmene (pracujeme s jedním kmenem, který byl ze vzorku izolován) nMetody nepřímého průkazu – spočívají v průkazu protilátek proti mikrobovi Postavení kultivace v systému metod nPřímé metody (mikrob – část – produkt): nMikroskopie – průkaz ve vzorku i identifikace nKultivace – průkaz ve vzorku i identifikace nBiochemická identifikace – jen identifikace! nPrůkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. nPrůkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku nPokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku nNepřímé metody (protilátky) Vzorek a kmen (opakování) nVzorek je to, co se odebírá pacientovi. Vzorek obsahuje buňky makroorganismu, různý počet druhů mikrobů (nula až třeba dvacet) a další příměsi nKmen – izolát – je populace jedné bakterie, izolovaná ze vzorku na pevné půdě nAbychom získali kmen, musíme bakterii pěstovat na pevné půdě a dobře rozočkovat Smysl kultivace bakterií nProč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? nAbychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) nAbychom získali kmen – můžeme použít pouze pevné půdy nAbychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci Pohádka nByla jednou jedna bakterie, a ta byla maličká, takže ji bez mikroskopu nikdo neviděl, a v mikroskopu bylo sotva vidět, jaký má tvar. Byla z toho velice nešťastná, protože si velice zakládala na tom, jak je zvláštní a zajímavá. nAž jednou přišel pan Koch. Ten bakterii posadil na pevnou půdu a schoval přes noc do termostatu. Bakterie zajásala a začala se vesele množit… A druhý den nPan Koch přišel, odevřel termostat, vyndal Petriho misku s půdou, a co neviděl: jeho milá, maličká bakterie, najednou byla viditelná pouhým okem! Ne ovšem jako jedna bakterie, ale jako celý kmen úplně stejných buněk, který z této jedné bakterie vzešel, v podobě kopečku – kolonie nBakterie byla celá šťastná, a předváděla se panu Kochovi v celé své kráse. Předvedla mu tvary, profily i povrch své kolonie, pigmenty a spoustu dalších věcí. Robert Koch koch.gif (8018 bytes) Německý mikrobiolog Robert Koch se narodil 11. prosince 1843 v.Clausthal-Zellerfeldu jako jedno z 13 dětí důlního technika. Už v pěti letech ohromil rodiče, když jim oznámil, že se podle novin naučil číst. V.roce 1862 odešel Koch na univerzitu do Göttingenu studovat medicínu. Po obdržení doktorátu v roce 1866 odešel na šestiměsíční studium chemie do Berlína. Po období všeobecné praxe se jako dobrovolník přihlásil do služby v ve francouzsko-pruské válce v roce 1870 a od roku 1872 do 1880 ve wollsteinském okresu. Zde uskutečnil své epochální výzkumy, které ho vynesly do čela vědeckých pracovníků. Zabýval se zejména bacilem antraxu, tuberkulózními bacily a cholerovým vibriem. Koch byl během života vyznamenám mnoha medailemi a odměněn mnoha cenami, získal také několik čestných doktorátů a stal se čestným občanem několika měst. V roce 1905 obdržel Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu. Robert Koch zemřel 27. května 1910 v Baden-Badenu http://www.quido.cz/osobnosti/koch.htm Ještě jednou Robert Koch http://www.educationforum.co.uk/kochlesson.htm Robert Koch in his Lab Robert Koch při expedici do Egypta při cholerové epidemii roko3.jpg (37534 Byte) Podmínky pěstování (kultivace) bakterií nPro kultivaci (pěstování) bakterií jsou nutné určité podmínky, bez kterých není pěstování možné nNestačí přitom takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit nPodmínky kultivace: voda, živiny, zdroj energie, teplota, atmosféra, pH, osmotický tlak - koncentrace solí, redox potenciál, růstové faktory, případně minerální látky nNepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se nNěkteré podmínky lze zajistit nastavením inkubátoru neboli termostatu (teplota, CO2), jiné složením půdy Když se mění určité faktory Fyzikální vlivy Kult1 Detektiv a půdy Kultivace bakterií obecně nBakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky nAerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry nStriktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku – Clostridium difficile nBakterie se speciálními nároky na kyslík vyžadují zvláštní zacházení nmikroaerofilní snížený podíl kyslíku 20 % - kampylobakter nkapnofilní zvýšený podíl CO2 asi 10 % - neisseria nPoužíváme různá kultivační média, sloužící k určitým účelům Kultivace bakterií obecně nVětšinou vyžadují teplotu kolem 37 °C, ovšem při různě širokém rozmezí. nAle bakterie původem z vnějšího prostředí preferují nižší teploty, ptačí patogeny naopak vyšší (ptáci mají vyšší teplotu těla) nVětšinou vyžadují pH kolem sedmi (6 - 8) nAlkalofilní - Vibrio cholerae (7,4 - 9,6) nAcidofilní - kvasinky, plísně, laktobacily (5 - 6) n Kultivace bakterií obecně nOsmotický tlak – běžné kultivační půdy 0,5 % NaCl nVyšší obsah solí - halofily nhalotolerantní - nevyžadují – enterokoky; stafylokoky - jsou zvyklé žít na zpocené kůži nobligátní halofily - nerostou za běžné koncentrace - Vibrio parahaemolyticus (1 % NaCl) Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae3 www.medmicro.info www.medmicro.info Pojem kolonie nKolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) nV některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) nPopis kolonií má významné místo v diagnostice nKolonie je vždy tvořena jedním kmenem. Pojmy „kolonie“ a „kmen“ ale nejsou synonyma, kmen nemusí mít tvar kolonie. S3 www.medmicro.info Kultivační doba nKultivační doba je časový úsek nezbytný k tomu, aby z jedné nebo několika bakterií vyrostla viditelná kolonie nKultivační doba je závislá na generační době, samozřejmě je ale daleko delší (pro vznik viditelné kolonie nestačí, když se z jedné bakterie stanou dvě, ba ani čtyři nebo osm, nezbytné jsou miliardy bakterií) Kult1 Praktická kultivace Význam kultivace v tekutých půdách Význam kultivace na pevných půdách Typy tekutých půd Typy pevných půd www.medmicro.info Kultivační podmínky – opakování nPro kultivaci bakterií jsou nutné určité podmínky nNestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit nPodmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí. Některé jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy. nNepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Je to dobře, nebo špatně, že různé bakterie jsou různě náročné? nJe to špatně, protože se špatně definují podmínky, které by vyhověli většině (neřkuli všem) klinicky významným bakteriím nJe to dobře, protože díky tomu můžeme i kultivaci využít v diagnostice (např. schopnost růst na půdě s 10 % NaCl dobře odliší stafylokoky od jiných bakterií, které na ní nerostou) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Fotoatlas\Kultivace a půdy\Kult1.jpg D:\Atlas (F)\atlas\bacteriology\clostridium\cloperf.jpg Půdy obecně versus půdy v.klinické mikrobiologii nV průmyslové mikrobiologii či v některých jiných aplikacích se zpravidla používají chemicky přesně definované půdy. Víme, kolik je v nich čeho, a můžeme taky sledovat, kolik čeho přibylo nebo ubylo. nV klinické mikrobiologii nepotřebujeme vědět přesné složení. Často i složky půd jsou chemicky nedefinované (krvinky, extrakt z kvasnic). C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Fotoatlas\Kultivace a půdy\Kult2.jpg D:\Atlas (F)\atlas\bacteriology\proteus\prmi32.jpg D:\Atlas (F)\atlas\bacteriology\salmonella\saenmal.jpg D:\Atlas (F)\atlas\bacteriology\salmonella\S32.jpg D:\Atlas (F)\atlas\bacteriology\bacillus\basu6.jpg Tekuté půdy a pevné půdy nZákladem tekutých půd je masopeptonový bujon (hovězí vývar + bílkovinný hydrolyzát). Používají se především k pomnožení. Výsledek se špatně hodnotí: v podstatě jen čirý bujon / zakalený bujon (roste /neroste) nZákladem většiny pevných půd je tentýž bujon, ale doplněný výtažkem z agarové řasy. Bakterie na pevných půdách rostou pomaleji, ale zato velmi rozmanitě, a lze je rozočkovat. C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Fotoatlas\Kultivace a půdy\Kult5.jpg Různé vzorky – různá kultivace nJak ovlivňuje typ vzorku typ kultivace? nVzorky, kde je obvykle málo mikrobů se dávají jen do tekutých půd, kde se mikroby rychle pomnoží. Teprve pak se (v případě zákalu = pozitivity) mikroby vyočkují (subkultivují) na pevnou půdu. Příklad: výtěr ze spojivkového vaku nVzorky, kde může být hodně i málo mikrobů a i případné malé množství mikrobů je významné, očkujeme na pevné i tekuté půdy. Pokud na pevné půdě nic vidět není, ale tekutá půda je zakalená, provádí se subkultivace (subkultura) z tekuté půdy na pevnou. Příklad: stěry z ran nVzorky, kde je většinou hodně mikrobů, popř. i fyziologická běžná flóra se očkují pouze na pevné půdy. Příklad: výtěry z krku C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Fotoatlas\Kultivace a půdy\Kult6.jpg Krevní agar je půda, která obsahuje ovčí červené krvinky C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\td\Betadelta.JPG C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Fotoatlas\Kultivace a půdy\Kult8.jpg C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Naše focené a scanované\Fotoatlas\Kultivace a půdy\Kult9.jpg F:\Documents\Noc vědců\P9250011.JPG nBakterie nKlebsiella pneumoniae nna Endově agaru D:\Atlas (F)\atlas\bacteriology\klebsiella\klpn35.jpg Tatáž bakterie na krevním agaru Použitá půda versus vlastnosti bakterií nRůzné vlastnosti, např. barvu, ovlivňují substráty přítomné v půdě, proto na různých půdách mohou mít bakterie různou barvu. nPochopitelně také například hemolýzu můžeme studovat pouze na půdách, které obsahují krvinky Pro připomenutí: Pojmy vzorek a kmen nVzorek je to, co se odebírá pacientovi. Vzorek obsahuje buňky makroorganismu, různý počet druhů mikrobů (nula až třeba dvacet) a další příměsi nKmen – izolát – je populace jedné bakterie, izolovaná ze vzorku na pevné půdě nAbychom získali kmen, musíme bakterii pěstovat na pevné půdě a dobře rozočkovat nNejdříve si ale probereme půdy tekuté, i když jimi kmen nezískáme… Tekuté půdy P1010001 www.medmicro.info Rozdělení tekutých půd nTekuté půdy mnoho kategorií nemají. Vlastně jen dvě: nPůdy pomnožovací jsou nejběžnější a univerzální. Příkladem je bujón pro aerobní kultivaci a VL-bujón pro anaerobní kultivaci (VL = viande-levure, z.francouzštiny – obsahuje masokvasničný extrakt) nPůdy selektivně pomnožovací mají za úkol pomnožit určitou bakterii a potlačit množení jiných. Příkladem je selenitový bujón pro salmonely Kult5 Pevné půdy www.medmicro.info Pevné (agarové) půdy nAbychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek à kmen), ale i kmen (kultivace kmen à kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. V praxi se zpravidla natře např. na polovinu misky tamponem a pak se rozočkovává kličkou. Někdy se ještě doplňují různé čáry a disky – o nich jindy. Proč je potřeba mít izolované kolonie nProtože jen v tom případě lze identifikovat větší počet patogenů, které jsou ve směsi nAle také proto, že pouze jednotlivé kolonie umožňují pozorovat typické vlastnosti kolonie. nSebelepší klaun vám nepředvede nic ze svého umění, držíte-li ho v kamrlíku nahečmaného na spoustu dalších klaunů. V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Rozočkování 1 – očkování směsi bakterií (naznačeny tečkami), 2 – výsledek kultivace: v prvních úsecích směs, až na konci izolované kolonie Postup očkování vzorku Očkování vzorku Vzorek se nanese na menší či větší plochu, a pak se rozočkovává jako při přeočkování kmene Výtěr z krku – reálný výsledek vytkrk www.medmicro.info Co lze popisovat u kolonií nVelikost nBarva nTvar (okrouhlý…) nProfil (vypouklý…) nOkraje (výběžky..) nPovrch (hladký, drsný) nKonzistence (suchá…) nPrůhlednost nVůně/zápach nOkolí kolonie* *Přesný význam tohoto pojmu záleží na druhu půdy. Například u půd s krvinkami se hodnotí narušení krvinek v okolí kolonie Pevné selektivní půdy nÚčelem je selektovat (vydělit) ze směsi baktérií pouze určitou skupinu nebo skupiny nPříkladem je agar pro stafylokoky s 10 % NaCl nNěkdy je selektivnosti dosaženo přidáním antibiotika. nKrevní agar s amikacinem je selektivní pro streptokoky a enterokoky. nPůdy pro kultivaci kvasinek zpravidla obsahují kombinaci antibiotik (abychom potlačili bakterie, kvasinkám antibiotika nevadí, takže rostou) Selektivita hypersolného agaru 6,5 % 10 % Většina Enterokoky Stafylokoky Kult6 Půdy diagnostické Kult11 nNepotlačují růst žádného mikroba nZato díky svému složení rozlišují mikroby podle určité vlastnosti nPříkladem je krevní agar ke sledování hemolytických vlastností a VL krevní agar (podobný, ale na anaeroby) nZvláštním případem půdy chromogenní a fluorogenní www.medmicro.info www.medmicro.info Půdy s krví – základ klinické mikrobiologie nVšechny půdy s krvinkami (krevní agar, VL krevní agar, agar s pranými erytrocyty apod. – netýká se ale krevního agaru s 10 % NaCl, kde jsou krvinky lyzovány) jsou schopny rozlišit: Hemolýzy Úplnou hemolýzu Částečnou hemolýzu Nepřítomnost hemolýzy Viridaci (zezelenání) Půdy chromogenní a fluorogenní 26 Chromogenní půda na listerie nChromogenní půdy obsahují barvivo, na které je navázaný specifický substrát à barevnost se ztrácí, není to už barvivo, ale chromogen nBakterie schopná štěpit specifický substrát změní chromogen zpět na původní barvivo nPůda může obsahovat i více chromogenů (pro současné určení více druhů bakterií) nFluorogenní půdy podobné, s.fluorescenčním barvivem www.oxoid.com Ukázka chromogenní půdy na kvasinky caal cagla cakru catro Čtyři různé kvasinky rostou v typických koloniích – jedna v zelených, jedna v modrých, jedna v suchých růžových a jedna v hladkých růžových. Ostatní druhy kvasinek jsou na této půdě bílé. www.medmicro.info Půdy selektivně diagnostické nKombinují v sobě selektivní a diagnostické vlastnosti nPříkladem půda Endova: nRostou pouze některé G- bakterie (selektivita) nTy, co rostou, lze rozlišit na laktóza pozitivní (červené) a negativní (bledé Kult9 Podobná je půda McConkeyho, ve světě běžnější Selektivně diagnostické jsou i půdy XLD, CIN aj. www.medmicro.info Půdy XLD a MAL na salmonely SAEN_XLD_Martínek SAEN_MAL_Martínek www.medmicro.info www.medmicro.info Kult3 www.medmicro.info Půdy selektivní, diagnostické a selektivně diagnostické – shrnutí Půda selektivní Kmen A neroste Kmen B roste Půda diagnostická Kmen C roste, má kolonie makové Kmen D roste, má kolonie takové Půda selektivně diagnostická Kmen E neroste Kmen F roste, má kolonie makové Kmen G roste, má kolonie takové Půdy obohacené a selektivně obohacené nJsou určeny pro náročné mikroby nObsahují různé nutriční faktory nPříkladem je čokoládový agar pro neisserie a hemofily a Levinthalův agar pro hemofily nMohou být selektivně obohacené (GC agar), tedy kombinace selektivity a obohacení Hemofil na ČA www.medmicro.info Půdy ke speciálním účelům atbstau17 atbpsae21 nSledování faktorů virulence (žloutkový agar pro histotoxická klostridia, půda s kongočervení pro stafylokokový sliz) nIn vitro testování citlivosti na antimikrobiální látky: Müllerův-Hintonové agar; slouží zároveň ke sledování pigmentů bakterií www.medmicro.info Poznámka nV případě kultivačně náročných bakterií se i testování citlivosti provádí na obohacených půdách. NEGO_ČAG_antibiotika www.medmicro.info Současné trendy v kultivaci nNavzdory rozvoji genetických metod si kultivace zachovává svou klíčovou úlohu při diagnostice zejména baktérií nStandardizace nutí přecházet od půd vyráběných „na koleně“ k půdám komerčně vyráběným nChromogenní a fluorogenní půdy se i přes vyšší cenu zvolna prosazují Anae3 Pěstování anaerobních bakterií Anae1 Anae2 www.medmicro.info Nashledanou nPříště budeme pokračovat povídáním o biochemické identifikaci bakterií P1010008 www.medmicro.info