‹#›
1
Lékařská mikrobiologie pro ZDRL
Týden 7:
A. Antibiotika III (dokončení)
B. Pokus na zvířeti
C. Genetické metody v mikrobiologii
Upraveno podle Ondřeje Zahradníčka

‹#›
2
Co nás dnes čeká
•Z antibiotik už jsme si probrali
–přehled antibiotik a jiných antimikrobiálních látek
–povídání o mikrobiálních rezistencích a polyrezistentních kmenech
–povídání o tzv. antibiotické politice
•Na dnešek nám zbylo testování citlivosti bakterií
•V další části přednášky si pak něco povíme o pokusu na zvířeti v mikrobiologii
•A v ještě další části pak něco o využití genetických metod (hlavně PCR)

‹#›
3
A. Zjišťování sekundárních rezistencí in vitro (v laboratoři):
Postavení v systému metod
•CÍL 1: ODHALIT PATOGENA
–Přímé metody (mikrob – část – produkt):
•Mikroskopie – průkaz ve vzorku i id.
•Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace
•Biochemická identifikace – jen identifikace!
•Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id.
•Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku
•Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku
–Nepřímé metody (protilátky)
•CÍL 2: ZJISTIT CITLIVOST/REZISTENCI PATOGENA NA ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY

‹#›
4
U kterých mikrobů se provádí?
•U virů se zatím neprovádí, i když u některých se léčí antivirotiky. Testování citlivosti na
antivirotika je zatím v experimentální fázi.
•U bakterií se provádí nejběžněji, i když jen u těch, které lze kultivovat (potřebujeme KMEN)
•Z hub se provádí jen u kvasinek, u vláknitých hub testovat citlivost na antimykotika nelze
•U parazitů se citlivost na antiparazitární látky netestuje (přestože rezistence někdy také
existují, například na antimalarika – zde se ale spoléhá na informace o citlivosti/rezistenci kmenů
v určité geografické oblasti)

‹#›
5
Metody zjišťování citlivosti in vitro
•Zjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři
•Nezaručí stoprocentní účinnost léčby
•Přesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií
lV běžných případech kvalitativní testy (citlivý – rezistentní)
lU závažných pacientů kvantitativní (zjišťujeme MIC)

‹#›
6
Příklady problémů při určování citlivosti
•U infekce močového měchýře je především důležité, jakou koncentraci má antibiotikum v moči, nikoli
ve tkáni. Některá antibiotika mohou vyjít jako citlivá, ale nemusí zabrat. Používají se zato
speciální antibiotika (nitrofurantoin)
•U abscesů, infekcí kostí a zejména u meningitid musíme počítat s tím, že mikroby dovnitř procesu
špatně pronikají. Nutná je znalost průniku jednotlivých antibiotik do jednotlivých tkání.
•U mikrobů ve formě biofilmu také nemusí antibiotikum zapůsobit, ačkoli je in vitro dostatečně
citlivé

‹#›
7
Difúzní diskový test
•Na MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie, nebo se suspenze na misku
přelije a pak zase odlije
•Pak se nanášejí tzv. antibiotické disky – papírky napuštěné antibiotikem
•Atb difunduje (prostupuje) z disku agarem
•Koncentrace antibiotika klesá se vzdáleností od disku
•Pokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý)
•Je-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý.

‹#›
8
Difúzní diskový test – 1
nAntibiotikum difunduje z disku, který je jím napuštěn, agarem. Čím dále od disku, tím je menší
koncentrace antibiotika. V určitém bodě antibiotikum přestává být schopno inhibovat růst dané
bakterie. (= koncentrace už je nižší než minimální inhibiční koncentrace – MIC)
Difusní test A

‹#›
9
Referenční mez
•Pro každé antibiotikum (respektive kombinaci antibiotikum-mikrob) je stanovena hranice (průměr
zóny), které musí naměřená zóna dosahovat, aby kmen mohl být hodnocen jako citlivý
•Pro zjednodušení si můžeme představit, že hranice odpovídá koncentraci, která se při léčbě ustálí
v séru pacienta („léčebná koncentrace“). Reálně se ale v praxi tato hranice určuje mnohem
složitějším způsobem.

‹#›
10
Difúzní diskový test – 2
nMožnost A: Hraniční („léčebná“) koncentrace neinhibuje růst mikrobů (je nižší než MIC). Růst
mikrobů by inhibovala až vyšší koncentrace. Naměřená zóna je menší než hraniční. Mikrob je na dané
antibiotikum rezistentní.
Difusní test B

‹#›
11
Difúzní diskový test – 3
nMožnost B: Hraniční („léčebná“) koncentrace inhibuje růst mikrobů (je vyšší než MIC). Naměřená
zóna je větší než hraniční. Mikrob je na dané antibiotikum citlivý.
Difusní test C

‹#›
12
Pamatujte si:
•V praxi sice porovnáváme zóny (měříme zónu v milimetrech a porovnáváme s hodnotou referenční
zóny), ale nepřímo vlastně porovnáváme koncentrace: MIC versus hraniční koncentrace
•Test je ovšem natolik nepřesný, že nelze jednoduše převést velikost zóny na MIC, chyba by byla
příliš velká a nepřijatelná

‹#›
13
Difusní diskový test po lopatě
Antibiotika
n1 Bakterie se bojí antibiotika. Velká zóna – někdy dokonce tak velká, že se ani nedá změřit.
n2 Bakterie se nebojí antibiotika, jsou na ně rezistentní. Malá či vůbec žádná zóna kolem atb
disku.
REZISTENTNÍ
CITLIVÝ

‹#›
14
Difúzní diskový test v praxi: zóny se změří a porovnají s referenčními
atbpsae21
www.medmicro.info

‹#›
15
Někdy jsou příliš velké zóny
negoca
Jsou-li zóny tak velké, že se nedají změřit, tak je neměříme a prostě rovnou napíšeme, že kmen je
na dané antibiotikum citlivý.
Zeleně jsou vyznačeny teoretické okraje zón – všimněte si, že z.naprosté většiny buď splývají, nebo
jsou mimo misku
www.medmicro.info

‹#›
16
Automatizace
•Automatizovaný odečet a interpretace citlivosti × rezistence k ATB
•Vhodný software umožňuje i sledování trendů v rezistenci k ATB a přispívá i ke sledování
nozokomiálních nákaz
cmd_93400_view
http://www.bio-rad.com/en-ca/sku/93400-adagio-system

‹#›
17
E-testy
•Podobné difúznímu diskovému testu
•Místo disku se však použije proužek
•V proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (speciální technologie, proto
taky je to drahé jak prase).
•Zóna není kruhová, ale vejčitá.
•Test je kvantitativní
•Na papírku je stupnice �
• à jednoduché odečítání
etest
www.uniklinik-ulm.de

‹#›
18
E-testy – vyhodnocení
•Hodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek
etest etest
www.uniklinik-ulm.de

‹#›
19
Co s naměřenou hodnotou MIC
•Naměřenou hodnotu MIC opět porovnáváme s referenční hodnotou – tentokrát ovšem nejde o zónu
měřenou v milimetrech, ale o koncentraci
•Referenční koncentraci říkáme breakpoint. I tady platí, že pro zjednodušení (pro pochopení) můžeme
vnímat breakpoint jako koncentraci dosahovanou při léčbě, ve skutečnosti to ale velmi často
neplatí.

‹#›
20
Hodnoty breakpointů
•udává Evropská komise pro testování antimikrobiální citlivosti (EUCAST)
•Případně Ústav pro klinické a laboratorní standardy (CLSI)

‹#›
21
01 caso01_4
www.unifesp.b
Někde používají speciální velké misky

‹#›
22
Mikrodiluční test
•Antibiotikum je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá
•Nejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC
•V přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen
citlivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní
•Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých
koncentracích (přesněji: dvanácté jen v sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu)

‹#›
23
Mikrodiluční test – ukázka
P3160025u
Foto O. Z.

‹#›
24
Příklad odečítání
•E: MIC >32, breakpoint =16, závěr: rezistentní
•F: MIC = 32, breakpoint = 16, závěr: rezistentní
•G: MIC = 8, breakpoint = 32 závěr: citlivý
•H: MIC £ 0,5, breakpoint = 8, závěr: citlivý
P3160025ux
E   F  G  H
E
F
G
H
32
64
128
64
16
32
64
32
8
16
32
16
4
8
16
8
2
4
8
4
1
2
4
2
0,5
1
2
1
0,25
0,5
1
0,5
V modrých obdélníčcích jsou breakpointy (ty jsou dané, neměří se)
V červených kolečkách jsou naměřené hodnoty MIC

‹#›
25
Interpretace stanovení MIC
•Zpravidla se pouze porovná MIC a breakpoint, a dle toho se výsledek vyhodnotí jako
citlivý/rezistentní
•Pokud je výsledek rezistentní jen těsně, lze v některých případech antibiotikum použít při zvýšení
koncentrace. Týká se to ale jen některých typů rezistencí a případů, kdy nelze použít jiné
antibiotikum, dělá se to jen po konzultaci antibiotického střediska.

‹#›
26
Bakterie v biofilmu
Jak už bylo řečeno, v případě biofilmu bakterie vzdorují i antibiotikům, na která jsou in vitro
citlivá. Existují snahy tento problém překonat. Experimentálně se používá měření MBEC (minimální
biofilm eradikující koncentrace).
Při měření MBEC se snažíme antibiotikem v různých koncentracích zlikvidovat biofilm vytvořený na
stěně plastového důlku. Poté prokazujeme růst mikrobů například pH indikátorem

‹#›
27
lenka 1

‹#›
28
Problémy
• Hodnoty MBEC jsou často mnohem vyšší než MIC. Při použití destičky s koncentracemi pro MIC se
může stát, že naměříme jen výjimečně nějakou hodnotu (vše ostatní bude „vyšší než“)
• Používáme proto často dvojici destiček, kterou si ovšem můžeme představit jako jednu destičku,
kde je každé antibiotikum v šestnácti různých koncentracích (místo osmi)

‹#›
29
Jak se odečítá MBEC
•Zelené kroužky označují důlky s hodnotami MBEC pro atb ve druhém až pátém sloupci.
•Pro antibiotikum v prvním sloupci nelze hodnotu MBEC určit i přesto, že jsme použili dvě destičky,
pořád je ještě příliš vysoká (vyšší než sledované)
1
A
B

‹#›
30
Zjišťování faktorů rezistence
•Někdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např.
betalaktamáz.
•Může se jednat o diagnostické proužky (chemický průkaz daného enzymu) nebo testy na jiném
principu.
•Používá se
–tam, kde testy citlivosti nedávají spolehlivé výsledky (z různých důvodů, např. nepůsobí testovaná
látka přímo, ale jeho metabolit, a podobně)
–tam, kde chceme prokázat konkrétní faktor rezistence, protože jde například o závažný faktor,
šířící se mezi pacienty

‹#›
31
Testování kmenů na produkci běžných betalaktamáz
•Používá se tam, kde výsledek difusního diskového testu, popř. ani mikrodilučního testu není
spolehlivý
•Zejména se to týká
Øneisserií (penicilin)
ØMoraxella catarrhalis (ampicilin)
ØHaemophilus influenzae (ampicilin)
•Provedení testu je buď stejné jako u stripových biochemických identifikačních testů (oxidázový
test), nebo jako např. u enterotestu

‹#›
32
Betalaktamázový test ve formě diagnostického proužku (stripu)
P1010061
Foto: O. Zahradníček

‹#›
33
Tentýž test ve formě důlků v mikrotitrační destičce
P1010059
Foto: O. Zahradníček

‹#›
34
Testování na produkci ESBL (širokospektrých betalaktamáz)
Mil02Pop
•U širokospektrých betalaktamáz má inhibitor betalaktamázy (např. kyselina klavulanová) svůj
účinek, i když není dle dostupných údajů dostatečný
pro léčbu in vitro. Lze ho však využít – činí-li rozdíl mezi zónami kolem disků cefotaximu
(ceftazidimu) bez inhibitoru a s ním více než pět milimetrů, je kmen považován za producenta
(širokospektré) b-laktamázy.
Foto O. Z.

‹#›
35
Výrazný ESBL producent
P1010040u
Foto O. Z.

‹#›
36
Testování kmenů na konstitutivní typ produkce betalaktamáz typu AmpC
•Betalaktamázy AmpC jsou druhem širokospektrých betalaktamáz. Na rozdíl od širokospektrých ESBL v
uším slova smyslu jsou ale kmeny (snad?) citlivé na cefalosporiny čtvrté generace
•Konstitutivní typ znamená, že rezistence je trvalá vlastnost
•Testuje se na běžném MH agaru a na MH s oxacilinem. Porovnává se rozdíl ve velikosti zón
citlivosti čtyř antibiotik.

‹#›
37
Stejný kmen na MH a na MH s oxacilinem: porovnejte
P1010025u P1010031u
MH + OXA
MH
Foto O. Z.

‹#›
38
Detaily předchozích obrázků
P1010025u P1010031u
MH
MH + OXA
Foto O. Z.

‹#›
39
Betalaktamázy ampC – inducibilní typ
•V tomto případě jde o takzvanou indukovanou produkci betalaktamázy. Rezistence se projeví jen v
případě současného působení kyseliny klavulanové. Betalaktamová antibiotika lze použít, ale opatrně
(pokud je lze nahradit jinými, raději je nahradíme)
•Projeví se tak, že v testu na průkaz ESBL kyselina klavulanová zónu nezvětšuje, ale naopak
zmenšuje

‹#›
40
Betalaktamázy ampC – inducibilní typ
02 IndianJMedMicrobiol_2005_23_2_120_16053_2
http://www.ijmm.org

‹#›
41
Metalobetalaktamázy (MBL) a KPC (K. pneumoniae karbapenemázy) metalobetalaktamázy
•Existují také testy na detekci metalobetalaktamáz, využívají například EDTA (chelát zachycující
ionty Zn2+) a testy na tzv. KPC betalaktamázy.
•Jde o betalaktamázy, při jejichž produkci je kmen rezistentní na všechny betalaktamy (u
metalobatalaktamáz s výjimkou aztreonamu)

‹#›
42
Detekce indukované MLS rezistence u stafyolokoků
•Na linkomycin sám je kmen ještě citlivý, rezistence však vzniká v přítomnosti erytromycinu.
Doporučuje se v těchto případech nepoužívat raději ani jedno z obou antibiotik
13 image056
http://web.med.unsw.edu.au

‹#›
43
B. Pokus na zvířeti a C. genetické metody: Pro zopakování
•Cílem mikrobiologických metod je zpravidla detekce patogena, popř. určení jeho citlivosti na
antimikrobiální látky.
•Patogena určujeme
–Přímými metodami
•detekce celého mikroba (jako morfologické či fyziologické jednotky)
•detekce jeho části (antigenu, DNA)
•detekce jeho produktu (například toxinu)
–Nepřímými metodami: detekce protilátek

‹#›
44
Přehled metod – opakování
•Přímé metody (práce se vzorkem či kmenem)
–Mikroskopie (nativní preparát, barvení…)
–Kultivace (na tekutých i pevných půdách)
–Biochemické a podobné identifikační metody
–Průkaz antigenu (pomocí protilátky)
–Pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity)
–Průkaz nukleové kyseliny
•Nepřímé metody
–Průkaz protilátek (pomocí antigenu)

‹#›
45
B. Pokus na zvířeti
•Pokus na zvířeti je jednou z nejstarších metod v.mikrobiologii. Byl neocenitelnou pomůckách v
dobách, kdy ještě nebylo k dispozici tolik umělých kultivačních médií, o dalších metodách ani
nemluvě. Dodnes se používá tam, kde ještě nenašel náhradu
01b

‹#›
46
Myš botulinová
•Autorem tohoto a dalších obrázků je Petr Ondrovčík. Obrázek je graficky upraven.
mysh0002 bar

‹#›
47
Historický význam pokusu na zvířeti
•V dobách Kocha a Pasteura se zjišťovalo, který mikrob vlastně souvisí s kterou nemocí. V této době
sehrála pokusná zvířata velice důležitou a nenahraditelnou roli
•Proto také pokus na zvířeti („pokusném hostiteli“) má své významné místo v rámci tak zvaných
Kochových postulátů.

‹#›
48
Myš tetanická
mysh0001 bar

‹#›
49
Kochovy postuláty
•Určitý mikrob je etiologickým agens (= původcem nemoci), pokud
1.je prokázán ve všech případech choroby a jeho rozložení v těle odpovídá pozorovaným poškozením;
2.je z hostitele vypěstován a v čisté kultuře udržován po několik generací;
3.takto vypěstovaným mikrobem lze napodobit onemocnění na jiném hostiteli;
4.je opět izolován z pokusně infikovaného hostitele.

‹#›
50
Zvíře jako měřítko virulence*
•Porovnáváme-li virulenci* různých druhů mikroba nebo různých kmenů stejného druhu, potřebujeme
tuto virulenci nějak vyčíslit.
•K tomuto účelu lze použít například LD50. Je to ukazatel virulence kmene: schopnosti usmrtit
•LD50 = 50% letální dávka. Je to množství mikroba, které usmrtí přesně ½ pokusných zvířat
Poznámka:
Napsáno „50 %“ se čte „padesát procent“
Napsáno „50%“ se čte „padesátiprocentní“
*Virulence = „jak moc je mikrob zlý“. Podrobněji rozebereme příště.

‹#›
51
Myš vzteklá
mysh0004 bar

‹#›
52
Použití zvířete
•Zvíře tedy můžeme použít
–jako kultivační médium, zejména tam, kde nelze použít kultivační médium neobsahující živé buňky
(viry, rickettsie, chlamydie)
–jako průkaz patogenního působení určitého kmene mikroba
–jako průkaz toxicity mikrobiálního toxinu

‹#›
53
Etický pohled na pokus na zvířeti
•Názory na pokusy na zvířatech se různí. Mnoho lidí by je chtělo úplně zakázat, většinou však
nedovedou říci, jak je nahradit
•Na druhou stranu je řada případů, kdy pokusy jsou prováděny zbytečně, to však není ani tak případ
zdravotnictví, jako především kosmetického průmyslu
•Legislativa pokusy na zvířatech povoluje, vyžaduje však splnění přísných pravidel

‹#›
54
mysh0005 bar

‹#›
55
Etické podmínky pokusu na zvířeti
•Každý chov pokusných zvířat podléhá schválení etické komise. Pro každý typ pokusu (ať už v rámci
diagnostiky, nebo výzkumu) musí být schválen projekt pokusu.
•V každém případě zvířata musí být chována za vhodných podmínek (teplota, vlhkost, kvalita vody,
potravy, prostorové podmínky apod.)
•Velmi přísné jsou požadavky na provedení pokusu a samozřejmě i způsob usmrcení

‹#›
56
Vědecké podmínky pokusu na zvířeti
•Má-li být pokus na zvířeti eticky alespoň do jisté míry ospravedlnitelný, nesmí být zbytečný, musí
mít tedy nějakou vypovídací hodnotu o daném případu.
•Snažíme se tedy vždy nalézt u zvířete typické příznaky dané choroby. Pokud to lze, prokazujeme
také, že zvíře neonemocní, pokud ho ochráníme specifickým způsobem, například podáním určité
protilátky.
•Každý pokus na zvířeti musí být pečlivě doložen a zdokumentován.

‹#›
57
Myš uhynulá
mysh0003 bar

‹#›
58
Myš
03 mouse
Velice důležité pokusné zvíře, používané v různých odvětvích mikrobiologie. Ve virologii se často
používají sající myšata, na kterých se pěstují viry. Viry totiž nejsme schopni pěstovat na
nebuněčných médiích. Myši se používají i v bakteriologii, například při průkazu tetanového toxinu
či botulotoxinu je pokus na myši stále metodou volby a není reálně nahraditelný.

‹#›
59
Králík
05 rabbit-01
Králík se také používá v řadě testů, zejména při diagnostice syfilis. Zde se používá takzvaný RIT –
rabbit infectivity test, test infekčnosti pro králíka. Dříve se používal ještě tzv. Nelsonův test,
kde se používal laboratorní kmen původce syfilis pěstovaný na králičích varlatech

‹#›
60
Morče
04 morče
Také morče se v mikrobiologii uplatňuje poměrně často. Nejčastěji se to týká diagnostiky
tuberkulózy

‹#›
61
Krysa
02 rat-on-sequencer-color
V praxi používána poměrné málo, spíše pro experimentální účely než pro praktickou diagnostiku

‹#›
62
•V určitých případech je nutno použít zvláštní zvířata, protože jiná nelze použít. Tak například
pro diagnostiku lepry se v určitých případech používá pásovec (na obrázku)
•Mnohá zvířata se také používají jako zdroj séra pro sérologické reakce. Zde lze použít např.
koňské či kravské sérum.

‹#›
63
C. Průkaz nukleové kyseliny
•Stejně jako pokus na zvířeti je to metoda komplikovaná a nákladná. Obě metody tedy používáme
většinou tam, kde běžně používané metody (mikroskopie, kultivace…) selhávají.
•Na rozdíl od pokusu na zvířeti však jde o metodu progresivní a velice se rozvíjející
•Průkaz NA je možný i z mrtvých buněk. To je výhodné u choulostivých mikrobů. Podařilo se např. i
prokázat NA původce tuberkulózy na kosterních pozůstatcích z XI. století.

‹#›
64
Důležité upozornění
•Nehodláme studenty učit principiální otázky týkající se molekulárních metod. K tomu jsou určeny
jiné předměty
•Naším cílem je seznámit studenty s.přehledem využitelnosti těchto metod v lékařské mikrobiologii.
•

‹#›
65
Rozdělení metod průkazu NA
•Metody bez amplifikace (genetické sondy). Jsou méně citlivé, to je někdy i výhoda
•Polymerázová řetězová reakce (PCR) velmi citlivá, stačí i jedna molekula DNA. Lze ovšem uměle
citlivost snížit.
•Ligázová řetězová reakce (LCR) je velmi podobná (ale zavedla ji jiná firma)
•Průkaz virové RNA je možný pomocí upravené PCR

‹#›
66
Použití metod průkazu DNA (RNA) v.klinické mikrobiologii
•Tyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není
vůbec možný
•Nehodí se příliš pro běžné patogeny přítomné všude. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly
kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí (týká se především metod s amplifikací)
•Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní

‹#›
67
Genové sondy bez amplifikace
•Jsou nejstarší z tohoto typu reakcí
•Používají se v diagnostice například chlamydiových infekcí
•Jsou méně citlivé, což může být i výhoda (nezachytí se tak snadno nějaké kontaminace)

‹#›
68
Genová sonda
01 genprobe54_35
www.pemed.com

‹#›
69
Použití genové sondy
02 genpca
www.chlamydiae.com

‹#›
70
Metody s amplifikací
•U nás se nejčastěji používá PCR, tedy polymerázová řetězová reakce
•Její vznik umožnilo získání termostabilní polymerázy z bakterie Thermus aquaticus z horkých
pramenů (proto se této polymeráze říká Taq polymeráza).
•Existují různé možnosti detekce jejích produktů (gelová elektroforéza, ELISA)

‹#›
71
LCR rusky J
03 LCR 04_0305
molbiol.edu.ru/review

‹#›
72
Základní schéma reakce PCR
•V první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý.
•V druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému
primeru
•Ve třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace
–Gelovou elektroforézou nebo
–Metodou ELISA (≠ serologická ELISA!!!)

‹#›
73
PCR proces
06 pcr-2
www.pcrstation.com/images
05 Wurtsmith_pcrpic
toxics.usgs.gov

‹#›
74
Postup izolace DNA pro PCR
pcr text

‹#›
75
Vývoj PCR byl umožněn výzkumem vedoucím k objevení Taq polymerázy z termofilní bakterie Thermus
aquaticus, která umí přežít vysoké teploty.
07 PCR_sketch_3

‹#›
76
Proč je důležitá interní kontrola
•Velmi běžným jevem je, že dochází k.tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností
různých interferujících látek (např. talek z rukavic)
•Proto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných
primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce
•Ovšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o
nukleotidy).

‹#›
77
04 thermocycler
Thermocyklery
kinich.cifn.unam.mx
08 110
http:///images/110.jpg

‹#›
78
Možné výsledky PCR
•Následující možnosti platí bez ohledu na způsob detekce (gelovou elektroforézou nebo ELISou)
•Pozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také
pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být.
•Negativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce
•Vzorek i IC negativní = inhibice reakce

‹#›
79
Přehled interpretace
Vlastní reakce
Interní kontrola
Interpretace
negativní
pozitivní
negativní
negativní
negativní
inhibice reakce
pozitivní
pozitivní
pozitivní
pozitivní
negativní
(vysoce) pozitivní

‹#›
80
Detekce výsledků PCR pomocí gelové elektroforézy
•Gelová elektroforéza je jednou z.možností detekce produktu PCR
•Produkty putují gelem od katody směrem k anodě a jsou zviditelněny pomocí UV-transluminátoru
•Každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC)
•Kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko

‹#›
81
Ukázka gelu (ladder, pozitivní kontrola, tři vzorky, negativní kontrola)
pcr gel

‹#›
82
pcrtbc upravený
Jiný příklad (upraveno dle www.medmicro.info)
Pacienti 1 a 4 – pozitivní, pacient 2 – negativní, pacient 3 – inhibice reakce. 5 – pozitivní
kontrola, 6 – negativní kontrola, 7 – ladder
ß Vlastní reakce
ß IC

‹#›
83
Druhá možnost – ELISA
•V tomto případě se produkt reakce detekuje pomocí reakce ELISA. Vysvětlení principu této reakce je
mimo rámec této přednášky.
•Důležité je, že i v tomto případě hraje zásadní roli interní kontrola. Pokud je negativní reakce
vzorku i kontroly, jde o inhibici reakce!

‹#›
84
Odběr a zasílání vzorku na PCR
•Pokud komunikujeme se zařízením, které hodlá provést odběr vzorku na PCR, je nutno mít na paměti:
–lze použít téměř jakýkoli vzorek, o kterém předpokládáme, že obsahuje mikroorganismy, po nichž
pátráme
–není nutno zajistit životaschopnost mikrobů (např. transportní půdou)
–naopak je třeba omezit riziko inhibice reakce à nejlepší je suchý tampón nebo holý kusový vzorek
bez nějakých úprav

‹#›
85
Interpretace vyšetření PCR
•Vyšetření PCR je vždycky nutno interpretovat zároveň s ostatními vyšetřeními
•Je potřeba vzít v úvahu, že je to přímý průkaz (neexistuje žádný „průkaz protilátek metodou PCR“,
jak je někdy požadováno)
•I pokud je PCR centralizováno (např. na genetice, na biochemii), mikrobiologické PCR by měl vždy
interpretovat mikrobiolog.

‹#›
86
Real time PCR, RT-PCR
•Sledování půběhu reakce (PCR) přímo během reakce
•pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením
své fluorescenční aktivity.
•výhody oproti konvenční PCR
•možnost přesného stanovení výchozího počtu kopií cílové templátové sekvence DNA – čili schopnost
kvantifikace
•Real-time PCR se provádí ve speciálních cyklerech, které umožňují teplotního cyklování i detekci
fluorescence v každém cyklu PCR

‹#›
87
Real time PCR, RT-PCR
•Kvantifikace se provádí prostřednictvím matematické analýzy amplifikačních křivek vzniklých
vynesením naměřené fluorescence oproti pořadovému číslu příslušného cyklu
•
.




Schema konstrukce kalibrační přímky

‹#›
88
•
twintec_real-time_PCR_plates01 real_t1
http://www.aub.edu.lb/fas/crsl/PublishingImages/real_t1.jpg

‹#›
89
RT-PCR, detekční systémy
•Prvními látkami používanými pro detekci akumulace produktu během real-time PCR reakce byl ethidium
bromid, SYBR Green I)
–jejich fluorescenční aktivita vzrůstá po vazbě na dvouřetězcovou DNA
–během PCR vzniká dvouřetězcový produkt - lze sledovat průběh amplifikace.
–nevýhoda detekují veškerou dsDNA přítomnou v reakční směsi včetně nespecifických produktů
amplifikace (jako jsou např. tzv. primer-dimer artefakty), které i při velmi pečlivé optimalizaci
metody velmi často vznikají

‹#›
90
RT-PCR, detekční systémy
•Elegantní řešení co se týče detekce nespecifických produktů nabízejí často využívané
oligonukleotidové sondy
–fluorescenčně značené oligonukleotidy, které hybridizují s určitou cílovou sekvencí uvnitř
amplifikovaného regionu a výrazně přitom zvyšují svou fluorescenční aktivitu
–výhoda je vysoká specifita, jelikož detekce cílové sekvence probíhá ve 2 stupních - na úrovni
vazby primerů a rovněž na úrovni vazby sondy.
•

‹#›
91
Nashledanou
•Příště budeme pokračovat povídáním o patogenitě a virulenci
Děkuji za pozornost
36 mor v Asii