DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay FluoroimunoanalytickáFluoroimunoanalytická metodametoda –– velmi citlivá metodavelmi citlivá metoda –– specifická metodaspecifická metoda StanoveníStanovení analytůanalytů –– nízkomolekulárníchnízkomolekulárních –– vysokomolekulárníchvysokomolekulárních –– finská firmafinská firma WallacWallac OyOy využívá časově modulované měřenívyužívá časově modulované měření fluorescencefluorescence chelátuchelátu lanthanidůlanthanidů –– EuropiumEuropium –– TerbiumTerbium –– SamariumSamarium –– DysprosiumDysprosium DELFIADELFIA -- principprincip Protilátka nebo antigen označeny fluorescenční sondou – chelátem lanthanidu – nejčastěji Europium Po proběhlé imunochemické reakci: – přidání „zesilovacího“ roztoku ke vzniklému komplexu • odtržení Eu z komplexu • přeměna Eu na nový intenzivně fluoreskující chelát ChelátyCheláty  komplexní (koordinační) sloučeniny centrálníhokomplexní (koordinační) sloučeniny centrálního atomu a dvojatomu a dvoj-- nebonebo vícevaznýchvícevazných ligandůligandů  ligandyligandy tvoří s centrálním atomem cyklickátvoří s centrálním atomem cyklická uspořádáníuspořádání •• chelátovýchelátový efektefekt -- významné zvýšení stabilityvýznamné zvýšení stability komplexů ve srovnání skomplexů ve srovnání s jednovaznýmijednovaznými ligandyligandy DELFIA Fluoreskující chelát (s novým - luminogenním - ligandem):  Fluorescence s velkým Stokesovým posunem fluorescenčního spektra (rozdíl mezi vlnovou délkou excitace a fluorescence) •• VzorekVzorek pulzněpulzně excitován zářením o vlnové délce 340excitován zářením o vlnové délce 340 nmnm •• Fluorescence měřena v dlouhovlnné části viditelného spektra (Fluorescence měřena v dlouhovlnné části viditelného spektra (EuEu -- 620620 nmnm)) –– eliminace pozadí (případná fluorescence matrice se projevuje poueliminace pozadí (případná fluorescence matrice se projevuje pouzeze vv krátkovlnnějšíkrátkovlnnější oblastioblasti)) DELFIADELFIA -- TimeTime--resolvedresolved fluorometryfluorometry (TRF)(TRF)  fluorescence je dlouhodobá • doba emise delší než u běžných fluoroforů - řádově stovky mikrosekund •• Fluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekFluorescenční záření se začne měřit se zpožděním stovek mikrosekund (začíná vund (začíná v době, kdy už vyhasla fluorescence pozadí, která je podstatně kradobě, kdy už vyhasla fluorescence pozadí, která je podstatně kratšítší –– nanosekundy) a samotné měření trvá také 400 mikrosekund.nanosekundy) a samotné měření trvá také 400 mikrosekund. •• Cyklus (Cyklus (pulsnípulsní excitaceexcitace -- prodlevaprodleva -- měření) trvá 1 milisekundu, během měřeníměření) trvá 1 milisekundu, během měření vzorku (1 sekunda) se tedy 1000x opakujevzorku (1 sekunda) se tedy 1000x opakuje DELFIADELFIA -- Vysoká citlivost a specifičnostVysoká citlivost a specifičnost DELFIA Uspořádání imunochemické reakce: -- kompetitivní:kompetitivní: -- fluorescenční sondou značený antigenfluorescenční sondou značený antigen -- intenzita fluorescence nepřímo úměrnáintenzita fluorescence nepřímo úměrná koncentracikoncentraci analytuanalytu ve vzorkuve vzorku -- nekompetitivní (sendvičové):nekompetitivní (sendvičové): -- fluorescenční sondou značenáfluorescenční sondou značená protilátkaprotilátka -- intenzita fluorescence přímointenzita fluorescence přímo úměrná koncentraciúměrná koncentraci analytuanalytu ve vzorkuve vzorku DELFIADELFIA -- současné stanovení vícesoučasné stanovení více analytůanalytů Fluorescence lanthanidů:  Úzké emisní píky při různých vlnových délkách (Eu 613 nm, Sm 643 nm)  Různá doba trvání fluorescence Eu, Sm -- Při měření se nepřekrývajíPři měření se nepřekrývají vlnové délky ani časyvlnové délky ani časy odečtu fluorescenceodečtu fluorescence EuEu aa SmSm -- umožňuje současnéumožňuje současné stanovení dvoustanovení dvou analytůanalytů DELFIADELFIA -- využitívyužití DELFIA lze použít pro široké spektrumDELFIA lze použít pro široké spektrum analytůanalytů ((v principu lzev principu lze lanthanidemlanthanidem označit každou stabilní sloučeninu obsahujícíoznačit každou stabilní sloučeninu obsahující aminoskupinuaminoskupinu):): •• ProteinyProteiny •• PeptidyPeptidy •• OligonukleotidyOligonukleotidy •• Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…)Malé organické molekuly (steroidy, aminokyseliny, léky,…) NovorozeneckýNovorozenecký screeningscreening (stanovení ze suché krevní skvrny):(stanovení ze suché krevní skvrny): •• TSH (kongenitálníTSH (kongenitální hypotyreózahypotyreóza)) •• 1717--hydroxyhydroxy--progesteronprogesteron (kongenitální(kongenitální adrenálníadrenální hyperpláziehyperplázie)) •• ImunoreaktivníImunoreaktivní trypsinogentrypsinogen IRT (cystická fibróza)IRT (cystická fibróza) DELFIA praktické provedení  Pracuje se v mikrotitračních destičkách v uspořádání 8x12 jamek se specifickou protilátkou (obvykle monoklonální) vázanou na pevné fázi DELFIADELFIA (suchá krevní skvrna) 11 Vyrážení terčíků (Vyrážení terčíků (razičkarazička)) 22 Dávkování činidelDávkování činidel 33 Inkubace, třepáníInkubace, třepání 44 Odstranění terčíků z jamekOdstranění terčíků z jamek 55 Promytí destičkyPromytí destičky 66 Měření naMěření na fluorometrufluorometru popo (vakuová(vakuová odsávačkaodsávačka) (promývačka) přidá) (promývačka) přidání zesilovacího roztokuní zesilovacího roztoku DELFIADELFIA –– suchá krevní skvrnasuchá krevní skvrna Diagnostický set obsahujeDiagnostický set obsahuje mikrotitračnímikrotitrační destičky,destičky, roztoky,roztoky, kalibrátorykalibrátory a kontroly (ve formě suché krevnía kontroly (ve formě suché krevní skvrny)skvrny) UmístěníUmístění kalibrátorůkalibrátorů, kontrol a pacientských vzorků na, kontrol a pacientských vzorků na destičcedestičce kalibrátorkalibrátor kontrola pacientkontrola pacient Softwarově zpracovaná kalibrační křivka:Softwarově zpracovaná kalibrační křivka: kompetitivní uspořádání sendvičové uspořádáníkompetitivní uspořádání sendvičové uspořádání DELFIA xx AutoDELFIA „Manuální“ linka DELFIA Analyzátor AutoDELFIA • Metodu DELFIA lze plně automatizovat při práci s kapalným materiálem (plasma, sérum) • Při práci se suchou krevní skvrnou není dosud běžná automatizace prvního kroku (vyrážení terčíků)