Biologie reprodukce & Embryologie Brno, Březen 2012 Gamety • Meióza • Struktura a vývoj • Rozdíly mezi vývojem vajíčka a spermie • Regulace gametogeneze • Ovariální a menstruační cyklus – vzájemný vztah • Transport gamet, kapacitace spermií, akrozomová reakce Oplození and časná embryogeneze • Kortikální reakce • Rýhování, morula, blastocysta • Aktivace embryonálního genomu • Embryonální kmenové buňky, přenos jádra (klonování) Lecture 3 Zygota Mnohobuněčné embryo Dynamický mnohobuněčný organismus STABILNÍ GENOM Genomická ekvivalence (= stejné množství DNA a stejná nukleotidová sekvence ve všech buňkách organismu – klonování) VARIABILNÍ TRANSKRiPTOM Regulátory transkripce X Embryologie: co vše zahrnuje? Embryonální x Fetální vývoj Všechny orgány jsou založeny Embryo Fetus 8. týden Fertilizace Týden 39-40 Porod Primitivní srdce začíná bít ve čtvrtém týdnu. 7 weeks Časné embryo před implantací K čemu je dobré pochopení principů reprodukce, vývoje gamet a embryonálního/fetálního vývoje? • Léčba neplodnosti • • Kontracepce • • Eliminace vývojových abnormalit Genetický základ vývoje gamet Vyšetření genetického stavu plodu (amniová tekutina) Porozumění efektům teratogenních agens Vyšetření uvnitř dělohy - sonografie Chirurgické zákroky uvnitř dělohy Další Moderní přístroje Kultivace buněk in vitro Molekulární biologie a genetika Proces rozmnožování • zajišťuje kontinuální propagaci jedinců daného druhu a tedy jeho trvalou existenci • klíčové pro rozmnožování je přenesení duplikátu DNA z rodičů na potomstvo • u drtivé většiny druhů je tento přenos zajištěn pomocí vysoce specializovaných buněk – gamet Jedinci odlišného pohlaví produkují odlišné gamety Základní předpoklad pohlavního rozmnožování Pohlavní rozmnožování prostřednictvím gamet se může jevit jako zbytečně komplikované a méně efektivní než rozmnožování nepohlavní, ale má velmi významnou adaptační úlohu. Tato adaptační úloha se realizuje díky unikátním genetickým procesům, které se odehrávají během vývoje obou typů gamet – vajíček a spermií. Přestože v mnoha morfogenetických detailech se vývoj vajíček a spermií mezi sebou výrazně liší, podstata klíčových genetických procesů je u obou shodná. Genetické procesy klíčové pro gametogenezu se odehrávají během meiotického buněčného dělení - MEIÓZY Tyto genetické procesy zahrnují: • Redukci počtu chromozomů • Nezávislou segregaci chromozomů • „Crossing over“ • • Redukce počtu chromozomů Proč? Somatická buňka Somatická buňka 2n 2n Potomek 4n Gamety musí mít haploidní počet chromozomů (n), aby splynutí gamet nevedlo u potomků ke znásobení počtu chromozomů nad diploidní počet (2n). Principielně by se redukce počtu chromozómů mohla snadno odehrát v jednom kroku vynecháním replikace DNA s následnou separací homologních chromozomů při jednom dělení buňky. 2n 1n 1n Meióza – dvě dělení místo jednoho replikace DNA tvorba bivalentů „crossing over“ 1. meiotické dělení Nezávislá segregace chromozomů 2. meiotické dělení Oddělení chromatid 2n 2C 2n 4C 1n 2C 1n 2C 1n 1C 1n 1C Plně funkční pohlavní buňky • „Crossing over“ • Nezávislá segregace chromozomů • Fertilizace jsou zdrojem genetické diverzity, která je základem adaptace živých organismů včetně ČLOVĚKA Spermie Vajíčka Význam pro vývoj embrya (reprodukci) Morfologické a fyziologické vlastnosti Vývoj a mechanismy, které jej řídí Genetická funkce O D L I Š N É S H O D N É X Primordiální zárodečné buňky – PGC • kmenové buňky, které jsou společné spermiím i oocytům • vznikají v žloutkovém váčku (extraembryonálně) • množí se mitotickým dělením a současně migrují do základu gonád (díky signálům z okolního prostředí – laminin, kit-ligand, TGF-beta1, …) • u člověka jsou pohlavně indiferentní až do ~6 týdne vývoje + • počet oocytů (folikulů) v ováriu je v okamžiku narození neměnně dán (u ženy ~500 000) • pouze malý počet oocytů se za život vyvine ve vajíčko schopné oplození (u ženy ~400) • v okamžiku menopauzy zůstává v ováriu díky atresii pouze malý počet oocytů (u ženy ~100-1000) • spermie se ve varlatech tvoří nepřetržitě od dosažení pohlavní dospělosti až do velmi vysokého věku (dvě varlata muže mohou každou sekundu vyprodukovat více než 1000 spermatozoí) VÝVOJOVÉ PROCESY ~0,12 mm Jedna z největších a „nejvzácnějších“ (počtem i významem) buněk v těle. Paradoxní buňka Vysoce specializovaná buňka Jediná buňka v těle samice, která je schopna projít meiózou a oplozením, a dát tak vznik novému individuu. „Totipotentní“ buňka Je schopna generovat buněčnou různorodost mnohobuněčného organismu. & Ani éra klonování nedokázala vzít vajíčku jeho nenahraditelnou úlohu ! Oocyt G2/M zástava mitotické dělení růst (měsíce až rok) meiotické zrání (hodiny) PGC & oogonie MI MII Znovuzahájení meiózy Zastavení meiózy v diplotene 1. meiotického dělení Vajíčko schopné oplození a podpory embryonálního vývoje Klíčová období vývoje vajíčka Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (1) Uvnitř ovária 30 mm 20 mm Výběr dominantního folikulu (nejcitlivější k FSH) Preantrální folikul (časné stádium) Rekrutovaný folikul Antrální folikul (střední velikost) Preovulační fol. (velký) Primordiální folikul ~14 dní Růst FSH- independentní Masivní produkce hormonů Androstendion Theca folliculi interna Estradiol Granulózní buňky Odehrává se v ováriu (současně s růstem folikulu) Je plně závislý na kontaktu oocytu s granulózními buňkami folikulu (např. protein „gap junctions“ connexin-37) Signál, který iniciuje růst není znám (není to FSH - hypofyzektomie nezabrání iniciaci růstu) Komunikace mezi oocytem a granulózními buňkami je obousměrná & & & kit-ligand GDF-9 Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (2) Růst oocytu Pomalý, u člověka několikaměsíční proces 100x zvětšení objemu – akumulace organel a molekul dávajících vajíčku schopnost podporovat vývoj embrya až do okamžiku získání autonomie (asi 105 mitochondrií oocytu podporuje vývoj embrya až do stádia blastocysty) Intenzívní transkripce - akumulace mRNA v dormantním stavu (regulováno polyadenylací a ???) růst oocytu Plně vyrostlý oocyt – ~2,5 ng RNA Intenzívní translace – mnoho proteinů (velmi omezené znalosti) Příklad: ZP1, ZP2, ZP3 – proteiny zona pellucida Plně vyrostlý oocyt – ~120 ng proteinu Transkriptom a proteom – podmiňují unikátní vlastnosti oocytu Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (3) Růst oocytu Reaktivace X chromozomu • somatické buňky – jeden X chromozom inaktivován hypermetylací cytozinů v molekule DNA • rostoucí oocyt – oba X chromozomy aktivní (nutné pro vývoj oocytu – karyotyp 45, X0 má za následek abnormální vývoj ovária) Genomický imprinting • epigenetická modifikace autozomálních chromozomů vedoucí k monoalelické expresi genů - umožněna aktivitou enzymu DNA metyltransferázy • PGC jsou globálně demetylovány • během růstu oocytu dochází k novému ustavení imprintingu (asi 40 genů) & Abnormality v imprintingu mohou být důvodem spontánních abortů při asistované reprodukci !!! (in vitro manipulace s gametami a embryi může vést k abnormalitám v imprintingu) Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (4) Epigenetické změny odehrávající-se během růstu plně vyrostlý oocyt (G2/MI) oocyt v MI oocyt v interfázi vajíčko v MII zygota Penetrace spermie GVBD člověk ~ 25 hodin LH Transkripce inhibována Translace aktivní X pokles cAMP Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (5) Poslední hodiny před ovulací – meiotická maturace Poslední pohled na ovárium Hormonální regulace ovariálního cyklu Hypotalamus Hypofýza Gonadotropin-releasing hormon (pulzy) Růst folikulů Meiotická maturace + Ovulace Corpus luteum Gonadotropiny FSH LH Menstruační f. Proliferační fáze Sekreční (luteální) fáze Ischemická Menstruační f. 0 5 14 28 5 27 Estrogen Progesteron + Estrogen Kde a jak se vývoj vajíčka odehrává ? (6) Vývoj spermií - Spermatogeneze (1) Minimální ejakulát (WHO) • Objem - 1.5 ml • Koncentrace spermií - 15.1 millions/ml • Motilita - 40% Spermie na vajíčku ~4 mm ~60 mm ~0.5 mm Vývoj spermií (2) Před pubertou Mitotické dělení spermatogonií v zárodečných pruzích Po dosažení puberty ~0.25 mm ~0.5 km Lumen Spermatocytogeneze (mitotická f.) Meiotická fáze Spermiogeneze Vývoj spermií (3) A0 Spermatogonie – Kmenové b. A1 Spermatogonie A2 Spermatogonie A3 Spermatogonie B Spermatogonie • Mitotické dělení • Spojení s bazální membránou • 2N, 4C Primární spermatocyty Sekundární spermatocyty - 1N, 2C 1. Meiotické dělení 2. Meiotické dělení Spermatidy – 1N, 1C Spermiogenize • Bez dělení !!! • Diferenciace Vývoj spermií (4) - Spermiogeneze Histony na Protaminy Inaktivace genomu Ztráta cytoplasmy Produkce spermií • 1 milion spermií každou hodinu • • Spermatogeneze trvá ~70 dní • • Transport nadvarletem trvá ~8-17 dní • Cyklický charakter (Cyklus semenotvorného epitelu – 16 dní – stejné vývojové stádium na stejném místě) Vývoj spermií (5) - Regulace 21-14 Sertoliho buňky •Podpora , ochrana, výživa •Fagocytóza •Bariéra krev-varle (zon. occlud.) •Anti-mullerian hormon •Produkce fruktózy •Produkce inhibinu (inh. FSH prod.) Leydigovy buňky •V intersticiu •10 % hmoty varlete •Produkce testosteronu Oplození (1) = proces, který kulminuje spojením jádra spermie s jádrem vajíčka v jeho aktivované cytoplazmě Kde se gamety potkají ? Ovárium Uterus Ovidukt Ampula Oplození (2) Oocyt se připravuje na penetraci spermií LH „peak“ Gráfův folikul 35-40 h Preovulační stádium Ovulace Oplození Fimbriae Infundibulum Oocyt je schopen oplození pouze 12 až 16 hodin Oplození (3) Cesta spermií do místa oplození Varle Seminální žláža Ductus deferens Nadvarle Bulbouretrální žláza Prostata Urin. bladder Uretra EJAKULÁT (2-6 ml) Spermie 200 – 600 milionů Producty přídatných pohlavních žláz • Cholesterol (v prostasomech) • Prostaglandin • Fruktóza • Vesikuláza (koaguluje ejakulát) Oplození (4) Cesta spermií do místa oplození Vagina 200-600 milionů spermií Vejcovod 100-1000 spermií Děložní krček Děloha 2 – 7 hodin • Čistí spermie • Cervikální hlen stabilizuje spermie • Zahajuje kapacitaci • Kyselé prostředí • Aktivní pohyb spermií • Odstranění glykoproteinů z hlavičky • Změna složení buněčné membrány • Vzrůst pohyblivosti Oplození (5) Proniknutí spermie do vajíčka Akrozomální reakce Zahájena kontaktem se ZP proteiny Uvolnění akrozinu, neuraminidázy, esteráz Zona pelucida Perivitelinní prostor Vstup do ooplazmy Fůze s oolemou Uvolnění hyaluronidázy Penetrace ZP Uvolnění lyzosomálních enzymů z kortikálních granul Modifikace ZP Blok polyspermie Ukončení II. meiózy Oplození (6) Vznik zygoty a první buněčná dělení Gap junctions Zygota Prvojádra fůzována (Syngamie) DNA syntéza Spermie • DNA • Cenriol • „Oocyte-activating factor“ Ooocyt • DNA • Mitochondrie • Cytoplasma ~6-8 h ~12-14 h ~3-4 dny ~8-12 h O v i d u k t D ě l o h a Vývoj blastocysty Kompaktovaná morula „Hatched“ blastocysta „Hatching“ blastocysta Expandovaná blastocysta 220-280 mm Trofoblast Blastocoel Embryoblast Den 5 – 6 (60 až 8O buněk) Vajíčko – výkonný regulátor exprese genů PB PN 20 44 G1 S G2/M G1 S G2/M Translace maternální mRNA Translace zygotické mRNA Zygotická transkripce Represe transkripce Význam „enhancerů“ Aktivace embryonálního genomu Aktivace embryonálního genomu Nepředstavuje jednu diskrétní událost (první známky již v zygotě, u člověka maximum ve 4- až 8-buněčném embryu) Transkripty nahrazující degradované maternální mRNA Nové transkripty určující zcela nový vzor genové exprese Dva typy transkriptů Je „zodpovědný“ za ustavení stavu totipotence blastomer Představuje fenomem označovaný REPROGRAMACE genomu & Přenos jádra (klonování) - princip Vajíčko Somatická buňka Reprogramace „Normální“ vývoj Klonování má nízkou efektivitu (1-3%) Reprogramace je pomalá a nejspíš nekompletní (výsledkem je abnormální exprese genů, ) Účinnost reprogamace je závislá na mnoha faktorech (typ somatické buňky, stadium buněčného cyklu, …) Aktivace Implantace blastocysty 0 5 14 28 Menstruační fáze Proliferační fáze (estrogeny) Sekreční fáze (progesteron) Ovulace následovaná Oplozením Funkční zóna endometria kompaktní + spongiózní + bazální Stroma Syncytiotrofoblast Embryoblast Epitel Trofoblast Molekulární hráči Selektin na trofoblastu + glykoproteiny na epitelu Integriny + Laminin, Fibronektin IGF1, IGF2, VEGF Metaloproteinázy + jejich tkáňové inhibitory Progesteron hCH Prostaglandiny Časná embryogeneza – Druhý týden (1) Ukončení implantace + Další embryonální vývoj • Pokračující invaze do endometria • Destrukce kapilár a žlázek • Pohlcování apoptotických buněk (Fas/Fas ligand) Trofoblast Cytotrofoblast • Mitoticky se dělící buňky (jedna vrstva) • Zdroj buněk syncytiotrofoblastu Syncytiotrofoblast • Fůzované buňky (nědělící se, mnohojaderné) • Produkce hCG (stimuluje CL) Lakuny trofoblastu Syncytiotrofoblast Děložní žlázka Endometriální kapilára Cytotrofoblast Amniová dutina Hypoblast Blastocoel Embryonální pól Abembryonální pól Stav ve dni 8 Epiblast Rozrůstání kapilár Diferenciace fibroblastů, akumulace glykogenu a lipidů Deciduální reakce endometria Stav ve dni 10 Stav ve dni 12 Syncytiotrofoblast Cytotrofoblast Epitelizace místa implantace 2-3 mm Houbovitá struktura Arteriální větev Venózní větev Lacuna Eroze endometr. kapilár Fůze lakun – vznik sítě dutin + Uteroplacentární cirkulace Časná embryogeneza – Druhý týden (2) Lidské embryonální kmenové (hES) buňky (Thompson et al, 1998) Časné embryo ve stadiu blastocysty Izolace embryoblastu (ICM - Inner Cell Mass) Přenesení izolovaného embryoblastu do in vitro podmínek (+ podpůrné buňky + FGF-2) Propagace v kultuře mechanickou či enzymatickou disagregací (opakovaným pasážováním) Thomson JPG Derivace postmeiotických zárodečných buněk z lidských ES buněk Prof. Harry Moore, University of Sheffield, 2009 B) C-KIT C) I-97 antigen D) Buňky s kondenzovaným chromatinem a náznakem bičíku Struktury velmi podobné komplexům oocyt-granulózní buňky (zóna pellucida nevyvinuta) Děkuji za pozornost ! Otázky a komentáře na: ahampl@med.muni.cz