Téma P02-03: Diagnostika streptokoků, enterokoků a G+ tyčinek K nastudování: Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium (z učebnic, internetu…) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace, Neutralizace Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 1 až 5 a 8 až 9 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S T U V W Gramovo barvení – Úkol č. 1 Kultivace – úkol 2 (pište jen základní charakteristiku) Kataláza – úkol 3a Slanetz-Bartley 3b Žluč-eskulin 3c Úkol 4a: Optochin (jen viridující str.) Úkol 5a: PYR test (jen hemolytické s.) Úkol 5b: CAMP (jen hemolytické s.) Úkol 5c (jen nAnB) Aglutinace Úkol 8: arabinóza Úkol 9: Růst na KA při 4 °C KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a rozlište grampozitivní koky a tyčinky a gramnegativní bakterie. U grampozitivních tyčinek si také všimněte uspořádání (palisády), velikosti (drobné, robustní), případně sporulace. Nátěry jednotlivých kmenů označte na sklíčku pomocí dermografu příslušným písmenem. Výsledky zapište do tabulky. S gramnegativní tyčinkou již dále nepracujte. Úkol 2: Kultivace na krevním agaru Na miskách s krevním agarem máte všechny kmeny. Zapište vlastnosti kmenů do tabulky jen nejnápadnější znaky (velikost, barva a především úplná hemolýza / částečná / viridace / nepřítomnost hemolýzy) Úkol 3: Základní kultivační a biochemické testy – rodové určení a) Katalasový test k odlišení stafylokoků Proveďte katalasový test se všemi kmeny z prvního úkolu s výjimkou toho, který jste v tomto úkolu vyřadili. Stafylokoky jsou katalasa pozitivní, streptokoky a enterokoky negativní. Z G+ tyčinek jsou pozitivní korynebakteria, listerie i bacily (avšak např. arkanobakteria by byla negativní). Zapište do tabulky. b) Růst na Slanetz-Bartleyově agaru k odlišení enterokoků Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Rostou však jen dva – enterokoky. Zapište výsledek do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinovém agaru k odlišení enterokoků a listerií Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Rostou však jen tři. V případě G+ koků platí, že tyto kmeny patří mezi enterokoky. U G+ tyčinek by mělo jít o listerii. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 4: Bližší určení streptokoků s viridací a) Optochinový test Máte za úkol vyhodnotit optochinový test u dvou kmenů, které jste určili jako streptokoky s viridací. Optochinový test je test, který se ničím neliší od běžného difúzního diskového testu až na to, že účinná látka (optochin) se nyní už nevyužívá léčebně. Kmen s přítomností zóny inhibice růstu kolem disku je S. pneumoniae, kmen bez zóny je „ústní streptokok“. Výsledek zakreslete a zapište do tabulky (tam stačí ve formě + / –) Jakákoli zóna znamená pozitivitu, absence zóny je negativní. Zónu není třeba měřit. b) Biochemické určení „ústního“ streptokoka V tomto praktiku se neprovádí. Vizte výklad učitele. (Odečítání je velmi podobné STAPHYtestu 16 z P01) Úkol 5: Určování streptokoků s částečnou či úplnou hemolýzou Tento úkol provádějte u tří kmenů, které jste určili jako streptokoky s úplnou nebo částečnou hemolýzou (části a, b); část c) pouze u kmene, který určíte jako non-A-non-B streptokoka. a) PYR test PYR test je proužkový test, podobný oxidázovému. Při odečítání barevné reakce je však nutno asi pět minut vyčkat, pak přikápnout kapku činidla pro PYR test a poté počkat další půlminutu. Pozitivní je zčervenání otisku. Také tento test je pozitivní u S. pyogenes (a také u enterokoků). Negativní je Streptococcus agalactiae i non-A-non-B streptokoky. Poznámka: Někdejší bacitracinový test se dříve používal místo PYR-testu. Jeho princip je shodný s principem optochinového testu, jen s jiným antibiotikem. Pro nedostatečnou specificitu byl již téměř opuštěn. Vyplňte následující tabulku, včetně zakreslení výsledku PYR testu u všech tří testovaných kmenů. Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Interpretace: negativní – pozitivní nehodící se škrtněte Interpretace: negativní – pozitivní nehodící se škrtněte Interpretace: negativní – pozitivní nehodící se škrtněte b) CAMP test Poznámka: CAMP test nemá nic společného s cyklickým adenosinmonofosfátem. Nazývá se podle jmen svých objevitelů. Proto se také píše CAMP test a nikoli cAMP test. CAMP test je založen na hemolytickém synergismu mezi kmenem S. aureus produkujícím beta-hemolyzin a kmenem S. agalactiae. Pozitivní výsledek má tvar dvou trojúhelníkovitých zón („motýlovitý tvar“) úplné hemolýzy v místě překřížení obou kmenů. Malá zóna jiného tvaru se považuje za negativní výsledek. Negativní je jak S. pyogenes, tak i non-A-non-B streptokoky. Nakreslete svůj výsledek do obrázku (na následující stránce): c) Demonstrace aglutinačního testu k bližšímu určení zejména non-A-non-B streptokoků U kmene určeného jako streptokok non-A-non-B by se mohlo provést určení séroskupiny aglutinací. Prohlédněte si na obrázku z dataprojekce výsledek takové aglutinace a zakreslete. Poté zaznamenejte do tabulky výsledky všech částí Úkolu č. 5, a zapište do tabulky definitivní závěr (určení jednotlivých streptokoků). Úkol 6: Testy citlivosti na antibiotika u streptokoků Vyhodnoťte testy citlivosti (difusní diskové testy) na antibiotika u těch kmenů streptokoků, které považujete za patogeny či možné patogeny; předpokládejme pro jednoduchost, že se jedná o kmeny z horních cest dýchacích. U kmene určeného jako non-A-non-B streptokok pro jeho malou patogenitu citlivost neurčujeme; u kmene určeného jako S. agalactiae (typický původce močových infekcí) použijeme sadu antibiotik určenou pro léčbu močových infekcí (obsahuje např. nitrofurantoin). Ve spojeném zubním praktiku se odečítá pouze test citlivosti na Streptococcus pyogenes. Interpretujte kmeny jako citlivé (C), intermediární (I) či rezistentní (R) k daným antibiotikům. Kmen L S Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Penicilin P ≥ 18 mm < 18 mm v tomto praktiku se neprovádí Erythromycin E ≥ 21 mm 18–20 mm < 18 mm Clindamycin DA ≥ 17 mm < 17 mm Chloramfenikol C ≥ 19 mm < 19 mm Tetracyklin* TE ≥ 23 mm 20–22 mm < 20 mm Vankomycin VA ≥ 13 mm < 13 mm Kmen P Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Penicilin P* ≥ 18 mm < 18 mm v tomto praktiku se neprovádí Tetracyklin* TE ≥ 23 mm 20–22 mm < 20 mm Vankomycin VA ≥ 13 mm < 13 mm Nitrofurantoin F ≥ 15 mm < 15 mm *interpretuje se jako ampicilin Úkol č. 7 Diagnostika pozdních následků streptokokových infekcí – vyšetření ASLO Princip – opakování z J07: Protilátky brání hemolyzinu (streptolyzin O – antigen) hemolyzovat králičí erytrocyty. Hladina ASLO se zvyšuje po nákazách vyvolaných hemolytickými streptokoky skupiny A (méně často i jiných skupin). Riziko pozdních následků streptokokových nákaz se projeví zvýšením ASLO nad 200 m. j. (mezinárodních jednotek). Na bočním stole naleznete ve vlhké komůrce destičku. Obsahuje pozitivní kontrolu a několik sér pacientů. Určete hodnoty ASLO (hodnota ASLO odpovídá poslednímu ještě pozitivnímu důlku; pozitivita = zábrana hemolýzy, negativita = hemolýza) a interpretujte z hlediska rizika pozdních následků streptokokové infekce. Úkol 8: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus faecalis). Výsledek zapište do tabulky na první straně. b) Biochemický test k druhovému rozlišení enterokoků ze závažných klinických materiálů (je schopen najít více než ony dva nejdůležitější druhy) V závažných případech raději použijeme spolehlivější druhové určení než je orientační určení arabinózovým testem ve zkumavce. Použijeme biochemický test v plastové destičce, v našich podmínkách nejčastěji EN-COCCUStest. V tomto praktiku se neprovádí, měli byste však vzít na vědomí jeho existenci (může být předmětem zkoušení např. při zápočtovém testu). Odečítá se podobně jako STAPHYtest 16 z P01, obsahuje však jen jeden řádek, a proto je jeho odečítání jednodušší. Úkol 9: Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Poznámka: Z praktických a časových důvodů vynecháváme testování citlivosti u enterokoků, korynebakterií a listerií. Difusní diskový test se odečítá podobně jako u jiných bakterií. U enterokoků na MH, u G+ tyčinek zpravidla na MH s krvinkami. Slovníček k dnešnímu tématu: V tomto protokolu (a v některých učebnicích) V některých jiných učebnicích viridace alfa-hemolýza částečná hemolýza beta-hemolýza úplná hemolýza žádná hemolýza/nepřítomnost hemolýzy gama-hemolýza