FAGOCYTÓZA
Fagocytóza je proces pohlcení a
degradace částic větších než 0,5 µm.
→ pohlceným materiálem mohou být cizorodé bakterie,
poškozené, odumřelé buňky či jejich části, minerální
částečky, atd.
FAGOCYTUJÍCÍ BUŇKY
neutrofil
eosinofil
basofil
monocyt
makrofág
dendritická b.
V periferii je cca 7% celkového množství fagocytů, zbytek je v
kostní dřeni, odkud se průběžně vyplavují a zároveň doplňují.
KREVNÍ DIFERENCIÁL
• využití průtokové cytometrie
• s mAb nebo bez nich
• granulocyty tvoří 40-65% všech leukocytů parfirení krve
GADJ=lymfocyty
PRŮBĚH FAGOCYTÓZY
• ADHEZE („rolling“) → cytometrie – defektní exprese leukocytárních integrinů Leukocyte
Adhesion Deficiency Syndromes (LAD1, LAD2)
• DIAPEDÉZA = průchod leukocytů cévní stěnou
• ROZPOZNÁNÍ OPONIZOVANÝCH ČÁSTIC
• CHEMOTAXE → test migrace pod agarózou
- ve směru chemotaktického gradientu (chemotaktické faktory, např.
IL-8, směřují fagocyty do místa zánětu)
• INGESCE → fagocytóza mikroorganismů nebo inertních částic
• DIGESCE - mechanismus nezávislý na kyslíku
→ mikrobicidní test, detekce enzymů
- mechanismus závislý na kyslíku
→ mikrobicidní test, NBT, INT, detekce myeloperoxidázy,
chemiluminiscenční test, „burst“ test
ROZPOZNÁVACÍ MECHANISMY
FAGOCYTŮ
Fagocyty jsou schopné rozpoznat struktury, které se
nacházejí na povrchu mikroorganizmů, ale ne na buňkách
vlastních. Tyto struktury jsou evolučně konzervované,
sdílené různými mikroorganismy a nezbytné pro jejich život.
Příklady:
• LPS (G-bakterie), peptidoglykany (G+ bakterie), glukany a manany
(kvasinky a plísně)
• Opsoniny – komplementové fragmenty (C3b), protilátky (Fc fragment IgG)
• Fosfolipidy - na povrchu vlastních apoptotických buněk (za normálních
okolností se nacházejí výhradně na vnitřní straně membrány)
PRO ROZPOZNÁNÍ RŮZNÉ
DRUHY RECEPTORŮ
Pro rozpoznání charakteristických mikrobiálních nebo
apoptotických komponent slouží fagocytům různé druhy
receptorů:
• manózové receptory rozeznávající cukerné struktury na povrchu
bakterií a některých virů
• scavengerové receptory – rozeznávají acetylované LDL
• chemotaktické receptory (fMLP)
• Toll-like receptory
• komplementové receptory
• Fc receptory
RESPIRAČNÍ VZPLANUTÍ
Stimulace povrchové membrány fagocytů
– aktivace NADPH oxidázy –
zvýšená spotřeba kyslíku a jeho přeměna na
reaktivní kyslíkové deriváty
O2
…
superoxidový anion
H2O2 … peroxid vodíku
1
O2 … singletový kyslík
HOCl ... kyselina chlorná
OH
.
... hydroxylový radikál
Glu-6-P HCO3
HMP
zkrat
NADP + 2H+ NADPH + H+
NADPH
oxidáza
O2 O2
+
O2
- + 2H+
Fe3+ /Fe2+ superoxiddismutáza
OH
. H2O2
(Haber-Weiss) myeloperoxidáza
+SCN
- +Cl
- +RH
HOCl
HOSCN + H2O2 + O2
- R
.
+ R-NH2
1O2 R-NHCl OH
.
• Správná funkce fagocytů je pro organismus nezbytná!!!
(hlídání adekvátnost zánětlivé reakce na cizorodou částici: cizorodá vs.
vlastní)
• Naopak hyperaktivace fagocytů – problémy:
poškození okolních buněk a tkání reaktivními metabolity a
proteolytickými enzymy
• Deficience ve funkcích fagocytů = těžký průběh banálních
infekcí
příklad: CGD (chronická granulomatóza) –
defektní NADPH oxidáza (častá
bakteriální a fungální onemocnění)
KLINICKÝ VÝZNAM FAGOCYTÓZY
• Kvantitativní test pro vyhodnocení oxidačního
vzplanutí u granulocytů a monocytů
• Fagocytující buňky se stimulují E. coli, fMLP a
PMA (3 různé zkumavky)-dochází k oxidačnímu
vzplanutí
• Ke vzorkům přidán DHR (dihydrorhodamin 123),
který je kyslíkovými radikály oxidován na zeleně
fluoreskující rhodamin 123
• Na průt. cytometru sledován počet (procento)
zeleně fluoreskujících granulocytů a monocytů
Burst test
CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA
ZDRAVÁ
KONTROLA
STIMULACE PMA
97%
PACIENT
STIMULACE PMA:
12%
BEZ STIMULACE STIMULACE PMA
ZDRAVÁ KONTROLA
PACIENT S CGD
STIMULACE E.Coli
CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA
(AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍ)
CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA
(X-VÁZANÁ)
DALŠÍ VYŠETŘENÍ FAGOCYTÓZY
• MIKROBICIDNÍ TEST
- zahrnuje všechny fáze fagocytárního děje
- sledování schopnosti fagocytů pohlcovat a usmrcovat živé kvasinky (C.
albicans); usmrcené kvasinky se z fagocytů uvolní deoxycholátem a jejich
množství se určí obarvením methylenovou modří (modré=usmrcené,
bílé=živé)
• NBT (INT) TEST
- poruchy v NADPH-oxidázovém systému
- při aktivaci fag. vznikají kyslíkové deriváty (peroxid vodíku, superoxidový
radikál) – tato aktivita je hodnocena redukcí tetrazoliových solí;
- bezbarvý roztok soli proniká při fagocytóze do buňky, kde je redukován na
nerozpustný barevný formazan; při extrakci měřitelný spektrofotometricky.
NBT = nitrobluetetrazolium
INT = iodonitrotetrazolium
• Fagocytující buňky
plná krev
izolované polymorfonukleární buňky
• Luminofory
luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phtalazinedione)
lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrát)
• Stimulátory
korpuskulární: škrob, opsonizovaný zymozan
solubilní: phorbol myristát acetát (PMA)
• Aktivita
spontánní
stimulovaná
TEST CHEMILUMINISCENCE
Chemiluminiscence je jev, kdy dochází v důsledku chemické reakce k emisi světla
Při procesech redukce molekulárního kyslíku vznikají elektronově excitované stavy, které
emitují fotony (světlo).
Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí fagocytů
DETEKCE KYSLÍKOVÝCH DERIVÁTŮ
VZNIKLÝCH V PROCESU
RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ
Zesílení přirozené chemiluminiscenční aktivity fagocytů
přídavkem luminoforu.
energie chemické reakce
LUMINOFOR LUMINOFOR*
energeticky bohatší, nestabilní
Uvolnění přebytečné energie ve formě světelných kvant
registrovatelných fotonásobičem luminometru.
PRACOVNÍ POSTUP
• Odběr venózní krve do heparinu (5j heparinu/1ml krve).
Krev 30 min inkubovat v termostatu při 37°C. Materiál
zpracovat do 120 min po odběru.
• Krev vyšetřit hematologicky (celkový počet leukocytů,
KO).
• U každého pacienta vyšetřit: spontánní aktivitu (bez
stimulace) i stimulovanou aktivitu (stimulace 1% rýžovým
škrobem).
• Pipetovací schéma:
AKTIVITA řádky MEM luminol škrob krev
SPONTÁNNÍ B,C,D 85 µl 10 µl x 10 µl
STIMULOVANÁ E,F,G 75 µl 10 µl 10 µl 10 µl
• Měření chemiluminiscence luminometrem ve 3 minutových
intervalech po dobu 45 min při teplotě 37oC.
• Hodnocení výpočtem integrované plochy pro spontánní i
stimulovanou aktivitu a její přepočet na 105 fagocytujících
buněk.
• Výpočet indexu metabolického vzplanutí (IMV).
• Klinický význam vyšetření:
- diagnostika chronické granulomatózy (defekt NADPH oxidázy )
- defekt myeloperoxidázy (srovnání chemiluminiscence lucigenin-luminol)
- vliv léčiv na fagocytózu
- septické stavy
KINETIKA RESPIRAČNÍHO VZPLANUTÍ
t [min]
CHL[RLU]
• Vmax … maximální produkce
fotonů (vrchol odpovědi)
• tmax … čas nutný k dosažení
maximální produkce fotonů
• Hodnota integrované
plochy pod křivkou …
vyjádření celkového množství
fotonů vyprodukovaných
systémem za definovaných
podmínek
Vmax
tmax