INSTRUMENTACE
RADIOIMUNOANALÝZY
Ing. Martina Podborská, Ph.D.
OKB FN Brno
Školní rok 2016/2017
Imunoanalytické metody
2
 stanovení bílkovin, antigenů, haptenů
(hormonů, léčiv, specifické IgE atd.)
 citlivější než imunoprecipitační metody
 vhodné pro koncentrace < 1 mg/l
 využívají značený indikátor (značenka = tracer)
– Ag nebo Ab
 značenkami mohou být:
 radioizotopy, fluoreskující látky, enzymy, substráty,
komplexy těžkých kovů, cheláty lanthanoidů
 podle typu značenky:
 izotopová imunoanalýza – RIA, IRMA
 enzymoimunoanalýza – EIA, IEMA
 fluoroimunoanalýza – FIA, IFMA
 luminoimunoanalýza – LIA, ILMA
 chemiluminiscence – ICMA, CLIA, ECL
3
 značenky umožňují detekovat volný n. na protilátku
vázaný Ag
 požadavky na značenku:
 snadná vazba na Ag nebo na Ab
 snadné měření + dobré rozlišení signálu a pozadí
 nesmí interferovat při reakci Ag a Ab
 levný a netoxický
 dle uspořádání imunoanalýzy rozlišujeme:
 KOMPETITIVNÍ: omezené množství Ab, značený je obvykle Ag
 NEKOMPETITVNÍ (imunometrická, sendvičová): Ab v nadbytku,
značená je obvykle Ab
 Heterogenní: vyžaduje separaci volné a vázané frakce Ag
 Homogenní: nevyžaduje separaci volné a vázané frakce Ag
Imunoanalytické metody
4
 nepřímá úměra mezi stanovovaným Ag a intenzitou
signálu:
Kompetitivní imunoanalýza
 1. stupňová:
 2. stupňová: 2-4 vyšší citlivost; nadbytek Ab v prvním kroku:
 vyžadují delší inkubaci
5
 přímá úměra mezi stanovovaným Ag a intenzitou
signálu
Nekompetitivní (sendvičová) imunoanalýza
Ag resp. Ab1-Ag-Ab2* – stanovovaný antigen/analyt;
minimálně 2 antigenní determinanty na Ag
Ab1 – většinou vázána na pevnou fázi
 mohou být 1 i 2 krokové
 2 krokové sendvičové metody poskytují nejvyšší
specifitu a senzitivitu
 citlivost metod souvisí s hranicí detekce značeného
ligandu
6
Kompetitivní
Rozdělení imunoanalytických metod
heterogenní: RIA, EIA (ELISA),
FIA, LIA
homogenní: EMIT, FPIA, CEDIA,
TRACE
Nekompetitivní
heterogenní: IRMA, IEMA, IFMA,
ILMA, CMIA, ECLIA (DELPHIA, MEIA)
homogenní: TRACE
7
 ZROD RIA:
 Rosalyn Yalow
(1921*) and
Solomon Berson
popsali první RIA
v r. 1957
 Nobelova cena za
fyziologii a
lékařství v r. 1977
RADIOZOTOPOVÉ IMUNOANALYTICKÉ
METODY (RIA)
Radioizotopové indikátory
 Výhody:
 flexibilita
 citlivost
 velikost molekul
8
 Nevýhody:
 toxicita
 poločas rozpadu
 dodatečné náklady

125I – gama zářič – poločas rozpadu 60 dní;
radiojód ve formě alkalických jodidů
 3H – beta zářič – poločas rozpadu 12,3 let;
když ze stérických důvodů nelze použít jód
(detekce beta zářice je obtížnější; dodává se
jako plyn (T2) nebo jako supertěžká voda (T2O)
9
 kompetitivní radioimunoanalýza:
 RIA – radioimunoanalýza (immunoassay)
 nekompetitivní (sendvičová) radioimunoanalýza:
 IRMA – imunoradiometrická analýza
 všechny izotopové metody jsou heterogenní
 měří se radioaktivní záření
 vysoce citlivá a specifická metoda
 RIA:
 Ab v tekutém stavu
 s Ab vázanou na pevné fázi
RADIOZOTOPOVÉ IMUNOANALYTICKÉ
METODY (RIA)
 kompetitivní heterogenní izotopová imunoanalytická
metoda (aldosteron,androstendion,17-OH-progesteron,TRAK)
 radioindikátorem je 125I = gama-zářič (poločas rozpadu 60 dní)
 g-counter se scintilačním detektorem se studnovým
scintilačním krystalem NaI + Tl – zářiče g (= oba přeměňují
energii IZ absorbovanou v roztoku na záblesky viditelného světla
(scintilace), které registruje fotonásobič)
10
 s každou sérií měření se zpracovává kalibrační křivka
 radioindikátorem značený Ag
 Ab v limitovaném množství (navázáno 20-80% značeného)
 g-counter Berthold  g-counter Wizard
RIA - Radioimmunoassay
RIA - Radioimmunoassay
 Ag a Ag* se odmyje, odsaje
 měří se radioaktivita imunokomplexu Ab-Ag*, která je
nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného Ag
11
 citlivost metody je
dána afinitou použité
protilátky
 Kompetice:
12
 radioaktivitou
značený Ag*
soutěží s
neznačeným Ag
o limitované
množství
vazebných míst
na protilátce
RIA - Radioimmunoassay
13
RIA - Radioimmunoassay
 Kompetice:
 radioaktivitou
značený Ag*
soutěží s
neznačeným Ag
o limitované
množství
vazebných míst
na protilátce
14
 čím větší množství neznačeného antigenu je přítomno,
tím menší množství značeného antigenu se naváže na
protilátku a opačně
 nepřímá úměra: čím větší intenzita signálu, tím menší
koncentrace stanovovaného Ag
RIA - Radioimmunoassay
 Kompetice:
15
 Ab je navázána na pevnou fázi („imunosorbentu“ = tzn. že vnitřní stěna
zkumavek je potažena Ab)
1. Pipetace:
 do zkumavek potažených Ab postupně napipetujeme:
kalibrátory/kontroly/vzorky séra/plazmy + radiondikátor
 směs se promíchá
2. Inkubace: 1–3 h při 18-250C za stálého třepání (350 rpm)
3. Měření: obsah zkumavek se pečlivě odsaje (tím oddělíme volné
imunokomplexy a volné Ag; neodsajeme pouze zkumavku pro stanovení
celkové aktivity T) a změříme cpm pro vazebnost (B) a celkovou aktivitu (T) po
dobu 1 min
 imunokomplexy a volné Ag se oddělí odmytím a odsátím
SCHÉMA POSTUPU RIA (komp.)
16
Stanovení aldosteronu
17
Stanovení aldosteronu
 g-counter Berthold
 RIA kit pro stanovení aldosteronu
18
1. Pipetace:
 do zkumavek potažených Ab postupně napipetujeme:
50 ml kalibrátory/kontroly/vzorky séra/plazmy
+ 500 ml radiondikátoru
(500 ml radioindikátoru do zkumavky nepotažené
Ab a určené pro stanovení celkové
aktivity)
 směs se promíchá
2. Inkubace: 3 h při 18-250C za stálého třepání (350 rpm)
3. Měření: obsah zkumavek se pečlivě odsaje (tím oddělíme volné
imunokomplexy a volné Ag; neodsajeme pouze zkumavku pro
stanovení celkové aktivity T) a změříme cpm pro vazebnost (B =
impulzy) a celkovou aktivitu (T) po dobu 1 min.
Stanovení aldosteronu
19
 kalibrační křivka:
Stanovení aldosteronu
Kalibrátory
Aldosteron
[pg/ml]
cpm (n=3) B/B0 [%] B/T [%]
0 0 15 800 100 47,29
1 12 12 788 80,9 38,28
2 48 10 728 67,9 32,11
3 231 7 176 45,4 21,48
4 668 4 883 30,9 14,62
5 2 431 2 904 18,4 8,69
Total cpm: 33 409 cpm
20
 kalibrační křivka:
Stanovení aldosteronu
47,29
38,28
32,11
21,48
14,62
8,69
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600
Kalibrační křivka
Koncentrace aldosteronu [pg/ml]
B/T[%]
Kalibrační křivka
 Výhody:
 vysoká citlivost
 robustnost
 malá spotřeba antiséra
 možnost automatizace
21
 Nevýhody:
 nebezpečí radioaktivního
záření
 krátká expirační doba
souprav
 nutno pracovat v sériích
 měřit v duplikátech
Je třeba dbát bezpečnostních předpisů pro
práci s radioizotopy!
RIA - Radioimmunoassay
Děkuji za
pozornost.