Lucie Říhová
OKH, FN Brno
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE
Princip a využití
Průtokový cytometr
flow cytometrie (flow+cyto+metrie)
specializovanější varianta fluorescenčního
mikroskopu v kombinaci s krevním analyzátorem
měření fyzikálních, chemických a biologických
vlastností až 106 buněk v suspenzi
Cytomics FC500 (Beckman Coulter)FACSCantoII (Becton-Dickinson)
Složení průtokového cytometru
1. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace
fluorescence navázaných barev
2. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku
a usměrňování jeho toku
3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků
dle λ pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory
4. Elektronika a počítačový systém - převod optického
signálu na elektronický a další zpracování
Složení průtokového cytometru
1. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace
fluorescence navázaných barev
2. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku
a usměrňování jeho toku
3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků
dle λ pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory
4. Elektronika a počítačový systém - převod optického
signálu na elektronický a další zpracování
detektory
fluorescencí
FS detektor
SS detektor
optické filtry
nosná
kapalina
buněčná
suspenze
polopropustná
zrcadla
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html
Světlo vs. buňka
Forward Scatter
- rozptyl světla v malém úhlu
- velikost buňky
Side Scatter
- rozptyl světla pod úhlem 90°
- komplexita buňky
Fluorescence
- přítomnost fluorochromu
detektor
detektor
detektor
Fluorochromy
excitace UV/violet diode (fialový laser) - 405 nm
- DAPI, Hoechst/Pacific Blue (452), AmCyan (491), BD Horizon 450 a 500
excitace Ar-iontovým laserem (modrý) - 488 nm
FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm)
Alexa Fluor 488 (519 nm)
PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm)
ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm)
PerCP - perridin chlorophyl (678 nm)
PerCPCy5.5 - tandem. konjugát PerCP-Cy5.5 (696 nm)
PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm)
PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm)
PI - propidium jodid, široký peak okolo 620 nm
excitace He-Ne laserem/red diode (červený) - 633 nm
APC - allophycocyanin (670 nm)
APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm)
Analýza a zobrazení
leukocytární gate
monocytární gate
lymfocytární gate
debris
FS lin
SS lin
FS - forward scatter - velikost buněk
SS - side scatter - granularita/komplexita
A
B
C
1-parametrová analýza
Histogram
osa x - intenzita fluorescence, osa y – počet buněk
hodnocení - odečet % pozitivních buněk
neg. peak = autofluorescence, izotypová kontrola
poz. peak - různá intenzita exprese
low (+/-) < dim (+) < high, bright (++) < very high (+++)
porovnávání intenzity exprese
Intenzita fluorescence (lineární nb logaritmická stupnice)
početbuněk
2-parametrová analýza
FITC
PE
I. kvadrant – FITC-PE+
II. kvadrant – FITC+PE+
III. kvadrant – FITC-PEIV.
kvadrant – FITC+PEI.
II.
III. IV.
Dot plot
dva parametry proti sobě - FLx vs. FLy, FLx vs. FS či SS
procentuální hodnocení - nejčastěji kvadrantová analýza
Sortování subpopulací
Bezprostředně po analýze
dochází piezoelektricky k
„trhání“ proudu vzorku na
kapky - obsahující jednu
buňku - přičemž požadovaným
buňkám = kapkám
je udílen el. náboj.
Tyto jsou pak v el. poli
vychylovány
a odseparovány.
udělení náboje
a separace
gateovaných bb
Stanovení povrchových a intracelulárních markerů
exprimovaných jednotlivými hodnocenými buňkami
vznik CD klasifikace v r. 1982, využívá k identifikaci
buněk tzv. CD markerů - Cluster of Differenciation,
def. cca 300 znaků (antigenů Ag) a není uzavřeno
historicky označeny nejprve leukocytární markery,
později zahrnutí dalších znaků (megakaryocyty,
trombocyty, erytrocyty…)
různá fce - buněčné enzymy, receptory mikrobiálních
Ag, transportní proteiny, prezentace Ag, Fc receptory,
komplementové receptory, regulační signalizační
receptory a jejich ligandy, adhezivní proteiny…
Imunofenotypizace - CD znaky
Hematopoeza
Identifikace subpopulací
pomocí MoAb proti znakům přítomným na povrchu
nebo v cytoplazmě buňky
na základě exprese CD markerů rozlišení subpopulací
buněk, jejich stádia vývoje a zralosti, patologie…
T lymfocyty CD1a - CD3, CD4, CD5 - CD8...
B lymfocyty CD19, CD20 - CD24, CD79 - CD84...
NK buňky CD16, CD55, CD56, CD57, CD244...
kmenové buňky CD34, CD117...
trombocyty CD36, CD41, CD42a, CD42b, CD61...
erytrocyty Gly-A (CD235a)...
leukocyty CD45...
monocyty CD14...
dendritické bb CD83, HLA-DR, ILT3...
Princip IFT
monoklonální protilátka (MoAb) konjugovaná
s fluorochromem (fluorescenční molekulou)
suspenze buněk s určitými povrchovými
či intracelulárními antigeny (Ag)
vizualizace specifické vazby MoAb-Ag
možnost kombinace několika MoAb
vizualizace mnoha znaků najednou
Anti CD3-FITC
Anti CD19-PE
+
plná krev
kostní dřeň
bb suspenze
vybrané protilátky
konjugované
s fluorescenční
barvou
+
=
označení buněk
vazbou protilátek
na odpovídající Ag
=
T
T
B
B
Vazba MoAb - Ag
Zpracování a analýza vzorku
Imunofenotypizace
typ vzorku - buněčná suspenze - nesrážlivá periferní
krev či kostní dřeň (EDTA, Heparin), BAL, kultivované
buňky, desintegrovaná lymfatická uzlina…
Inkubace - se specifickou monoklonální protilátkou
proti požadovaným znakům (T, B, NK buňky…)
lyzace erytrocytů - pokud jsou obsaženy v suspenzi
osmoticky, enzymaticky či chemicky
fixace - 0,5% paraformaldehydem
proplach - vymytí nadbytečné protilátky pomocí PBS
analýza - získání listmode a vyhodnocení histogramů
Klinické využití FC
Rutinní vyšetření a výzkumné analýzy
imunologie
hemato-onkologie
transplantologie
transfuziologie
hematologie
Imunologie
Analýza imunokompetentních buněk (IFT)
subpopulace T, B, NK buněk
dif. dg. imunodeficiencí apod.
Analýza autoprotilátek
proti leukocytům, erytrocytům či trombocytům
Analýza funkce neutrofilů
oxidativní vzplanutí
fagocytóza
Základní populace lymfocytů
T lymfocyty
- cytotoxické: CD3+CD8+
- pomocné: CD3+CD4+
B lymfocyty
- B2: CD19+CD20+
- B1: CD5+CD19+CD20dim+
NK buňky
- CD3-CD16+CD56+
- NK-T: CD3+CD56+
CD8-FITC/CD4-PE/CD45-PC5/CD3-PC7
CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PC5/CD19-PC7
CD45+ lymfocyty
CD45+ lymfocyty CD45+ lymfocyty
CD45+ lymfocyty
Absolutní počty buněk
Využití firemního roztoku s přesně definovaným počtem
částic na µl a fluorescencí ve všech kanálech
zadáván jako kalibrátor
shodný objem vzorku a kalibrátoru
HIV+ pacienti - stanovení abs. počtu CD4+ helper T lymfocytů
558 bb/ul1135 bb/ul 11 bb/ul
CD45+ lymfocyty CD45+ lymfocytyCD45+ lymfocyty
Stanovení HLA-B27
přítomnost alely HLA-B27 je asociována s řadou
nespecifických zánětlivých onemocnění.
exprimována u 90% pacientů postižených ankylózní
spondylózou (AS)
screeningové vyšetření u pacientů trpících záněty
sakroiliálních meziobratlových plotének → indikace AS
MFI pacient - 2172MFI kontrola - 63kalibrace CD3+ T lymfocyty
Transplantologie
Zjištění zastoupení hematopoetických kmenových buněk
CD34+ leukocyty (hematopoietic stem cell, HSC)
v rámci transplantace kmenových buněk
monitorování PK po stimulaci G-CSF, v transplantátu…
analýza pupečníkové krve…
Vymezení leukocytů Označení mrtvých bb Vymezení CD45+
leukocytů
Označení CD34+ HSC
Hemato-(onkologie)
Analýza povrchových a intracelulárních
markerů - imunofenotypizace
dif. dg. leukémií, lymfomů apod.
analýza stavu onemocnění (remise, relaps…)
stanovení minimální reziduální nemoci
DNA analýza
ploidita a proliferace buněk
Analýza apoptózy a nekrózy…
Kdy provádět IFT?
cytopenie (zejména bicytopenie a pancytopenie)
leukocytózy (lymfocytózy, monocytózy a eozinofilie)
nález atypických buněk či blastů v PK, KD či jiných TT
zvýšený počet plazmocytů, monoklonální gamapatie
organomegalie či nález tkáňové masy
neutrofilie ze zralých buněk
polyklonální hypergamaglobulinémie
polycytémie, trombózy a bazofílie
Diferenciální diagnostika
hematologických malignit
Vychází ze znalostí exprese povrchových
a intracelulárních molekul v průběhu diferenciace
krevních bb
přítomnost patologických buněk s odlišným fenotypem
liniová příslušnost (lymfoidní, myeloidní, monocytární aj.)
diferenciační stupeň hematologických malignit
analýza smíšeného fenotypu u leukémií
detekce aberantně exprimovaných markerů
Akutní myeloidní leukémie
Klonální neoplastická proliferace myeloidních blastů
Antigeny prekurzorových buněk: CD34, CD38, CD117, HLA-DR, TdT
Myeloidní antigeny: CD13, CD15, CD33, CD65, MPO
Antigeny monocytární diferenciace: CD14, CD4, CD64,
CD36, CD11b, CD11c
leukocyty leukocyty
Lymfoproliferace - B-CLL
Patologické B1 (CD5+CD19+) lymfocyty přítomny v PK
- vesměs charakteristický fenotyp CD20dim+CD23+
- bez exprese povrchových kappa/lambda lehkých řetězců Ig
CD5+CD19+ CD20dim+ sκ-/sλ-
CD23dim+
Malignity z PC
plazmocyty (PC) fyziologicky přítomny v nízkém
zastoupení - produkce vlastních MoAb
zvratem v diferenciaci vznikají maligní PC
- prekanceróza - MGUS (nízký počet maligních PC)
- kumulace maligních PC v KD - mnohočetný myelom
charakteristický fenotyp
rozlišení fyziologických CD19+ a patologických CD56+ PC
myeloma stem cells - CD138-CD34-CD27+
vysoký stupeň proliferace
schopné diferenciace do maligních CD138+bb
Analýza PC u MG
normální
CD19+CD56-PC
abnormální
CD19-CD56+PC
CD38+CD138+ PC
Nejčastější aplikace u PLT I.
Diagnostika dědičných či získaných defektů
Glanzmanova trombocytopenie (GPIIb/IIIa - CD41/CD61)
Syndrom Bernard Soulier (GPIb/IX - CD42b/CD42a)
Syndrom šedých destiček (P-selektin - CD62P)….
Aktivace PLT in vivo
analýza na aktivaci závislých Ag (CD62P)
analýza PLT-PLT agregátů, případně agregátů s Leu
(CD62P iniciuje interakci s PSGL-1 na leukocytech)
destičkové mikropartikule
Defekty PLT GP
Glanzmanova trombastenie
Krvácivý stav
CD61 CD41
CD36
Nejčastější aplikace u PLT II.
Transfuziologie
monitorování koncentrátů PLT
(zbytkové WBC, aktivace PLT - ↑ CD62P, ↓ CD42b)
detekce s PLT asociovaných Ig
(potransfuzní reakce, ITP)
Analýza PLT obratu
detekce retikulovaných PLT
(kvantifikace nezralých destiček - stupeň trombopoezy)
počty PLT
Hereditární sférocytóza
nejčastější vrozená hemolytická anémie
molekulární defekty membránových proteinů
erytrocytů (spectrin, band 3…)
narušený bikonkávní tvar
destrukce ve slezině
diagnostické testy
sférocyty, osmotická rezistence, autohemolýza
kryohemolýza
průtoková cytometrie
vazba kyseliny eosin maleimidové (EMA) na erytrocyty
- analýza snížení fluorescence oproti kontrole
Hereditární sférocytóza
MFI - medián intenzity fluorescence EMA = poloha peaku na ose X
MFI P/MFI K= EMA ratio ~ 1 u pacientů bez HS a <0,9 u HS
K - kontrolní vzorek
P - pacient s HS
K - kontrolní vzorek
P - pacient s HS po
transfuzi ERY
EMA ratio
= 33,6/46,8 = 0,72 EMA ratio
= 43,3/42,4 = 1,02
zbytkové patologické
erytrocyty na pozadí
transfundovaných
PNH
Paroxysmální noční hemoglobinurie
získaná mutace → membránový defekt kmenových
buněk a jejich diferencovaných forem (WBC, RBC, PLT)
chybějící glykosyl-fosfatidyl-inositolová (GPI) kotva
→ klon s chybějícím membránovým proteinem
diagnostika průtokovou cytometrií
▫ erytrocyty - chybění CD59 (CD55 nespecifické)
▫ leukocyty - chybění FLAER (MoAb proti GPI)
PNH - erytrocyty
1. identifikace erytrocytů
99,9% CD235a+ bb
0,05%
CD59dim+
0,7%
CD59-
99,25%
CD59+
PNH II
PNH III
2. Analýza přítomnosti CD59
PNH - leukocyty
1. identifikace monocytů
a neutrofilů
2. Analýza přítomnosti FLAER
CD64+ monocyty
CD15+ neutrofily
0,5% FLAER- leukocytů
0,5% monocytů 0,5% neutrofilů
Hmotnostní Cytometrie
Nový přístup využívající stabilní izotopy kovů
jako „značky“ spolu s jejich detekcí pomocí
atomové hmostnostní spektrometrie
značky jsou spojeny s MoAb kompatibilními
s povrchovými i či intracelulárními znaky
buňky jsou vaporizovány, atomizovány
a ionizovány, poté je měřena
základní kompozice
simultánní detekce až 30
parametrů jedné buňky
bez nutnosti kompenzace
SPADE
Zobrazovací cytometrie
Flow cytometr se zobrazovacími a funkčními
vlastnostmi mikroskopu
přímé zobrazení buněk s 60 násobným rozlišením
simultánní fenotypové a funkční analýzy
s využitím 5 laserů a 12 zobrazení na buňku
Výhody a nevýhody FC
FC analýza povrchových i intracelulárních markerů
je citlivá a kvalitativní metoda (lze i kvantitativně)
simultánní analýza několika markerů na vysokém
počtu buněk
paralela k morfologickému vyšetření - upřesnění dg.
chybí informace morfologická
občas nejednoduchá interpretace
flowcytometr a fluorescenčně značené protilátky jsou
poměrně drahé