P03
Diagnostika některých
dalších grampozitivních
bakterií (enterokoků,
listerií, korynebakterií a
bacilů)
VLLM0522c (podzim 2016)
Osnova
●
rod Enterococcus
●
G+ tyčky
●
diagnostika enterokoků a G+ tyček
●
úkoly
2/32
Rod Enterococcus
●
G+ koky, ve dvojicích nebo krátkých řetízcích
●
fakultativně anaerobní, KAT-, OXI-
●
vysoce odolné: až 6,5 % NaCl, 40 % žluči, azid
sodný (půda Slanetz-Bartley), pH 4,8 až 11,
půlhodinové zahřátí na 60 °C, primární rezistence na
cefalosporiny
●
součástí normální mikroflóry střeva
●
původci močových infekcí, nozokomiální kmeny jsou
často rezistentní (bakteriémie, katetrové sepse,
meningitidy, endokarditidy, inf. žlučových cest, …)
●
E. faecalis (90 %), E. faecium (5–10 %)
●
VRE – vankomycin rezistentní enterokoky 3/32
Rod Enterococcus (2)
●
G+ koky, dvojice, řetízky
●
žluč eskulinový agar (tmavě hnědé
až černé drobné kolonie nebo zbarvují
dvorec kultivační půdy černě)
●
půda Slanetz-Bartley (růžové až červené kolonie)
4/32
medmicro.info;
prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc.
Rod Listeria
●
G+ tyčky, krátké,
●
fakultativně anaerobní, KAT+
●
odolné (růst při vyšších koncentracích NaCl nebo
žlučových solí, růst při nízkých teplotách)
●
L. monocytogenes (listerióza), L. ivanovi (listerióza
ovcí)
●
listerióza:
– nejčastěji alimentární infekce (nedostatečně
pasterované mléko, sýry, krůtí a drůbeží maso,
zelenina)
– nejčastěji probíhá bezpříznakově, popř.
nevolnost, zvracení, průjem
5/32
Rod Listeria (2)
●
listerióza:
– nejnebezpečnější u oslabených jedinců (nemoc,
stáří, gravidita)
– infekce ran, meningitida, meningoencephalitida nebo
encefalitidami dospělých
– infekce placenty, plodových obalů a celkové
generalizované onemocnění plodu provázeného
sepsí
– potraty ve druhém a třetím trimestru, narození
mrtvých nebo těžce nemocných novorozenců
(umírají brzy po porodu)
6/32
Koryneformní tyčky („difteroidy“)
●
termín používaný zpravidla pro nesporulující G+
tyčky, kyjovitého tvaru, někdy rovné či zahnuté
●
v minulosti všechny v rodu Corynebacterium
●
vytvořeny nové rody (Arcanobacterium, Rhodococcus,
Dermatophilus, Turicella, …)
●
Arcanobacterium haemolyticum – tonsilitidy, infekce
ran; KAT-, reverzní CAMP test
●
Rhodococcus equi – infekce imunokompromitovaných
pacientů (transplantace, AIDS)
7/32
Reverzní CAMP test
8/32
Rod Corynebacterium
●
G+ nesporulující tyčky
kyjovitého tvaru,
někdy pleomorfní
●
typické uspořádání
v palisádách a
tzv. havraních křídlech
●
fakultativně anaerobní, půdy s teluričitanem
●
odolné k vyschnutí a NaCl, nerostou na agaru bez
přídavku krve
●
Corynebacterium diphtheriae
●
nedifterická (=nezáškrtová) korynebakteria
(součást mikroflóry kůže)
9/32
Corynebacterium diphtheriae
●
původce záškrtu (diftérie)
●
difterický toxin (nezbytná přítomnost genu tox,
přenášený β-bakteriofágem, ireverzibilně blokuje
proteosyntézu zánik infikované buňky)→
●
pseudomembrána z fibrinu, pod níž jsou bakterie
produkující toxin nekróza okolních buněk→
●
pseudomembrány vznikající ve sliznici HCD mohou
vést k jejich mechanické obstrukci, edému sliznice a
následně k udušení
●
akutní infekce léčena podáním antitoxinů
●
prevence očkováním (hexavakcína)
10/32
Corynebacterium diphtheriae (2)
masivní zvětšení krčních
uzlin u diftérie
11/32
pseudomembrána
Nedifterická korynebakteria
●
součástí běžné mikroflóry kůže
●
infekce ran, katétrové sepse, postihují vnitřní orgány
při průniku do organismu
●
Corynebacterium jejkeium:
– dříve „korynebakterium skupiny JK“
– nozokomiální infekce (až 40 % hospitalizovaných
pacientů, zřídka na kůži zdravých jedinců)
– katétrové sepse, polyrezistence
●
Corynebacterium pseudotuberculosis – lymfadenitidy,
pneumonie, záněty kůže
●
Corynebacterium urealyticum – pyelonefritidy, cystitidy
12/32
Rod Bacillus
●
G+ tyčky, robustní, rovné až konkávní konce, tvoří
endospory, často pohyblivé, obvykle KAT+
●
většina zástupců běžně přítomna v prostředí (tvorba
endospor)
●
v klinickém prostředí časté kontaminace
●
podle morfologie spor rozdělení do tří skupin:
– oválné spory, nevyklenují buňku (B. anthracis,
B. cereus, B. subtilis, ...)
– oválné spory, vyklenují buňku
(G. stearothermophilus, B. polymyxa, ...)
– sférické spory, vyklenují buňku (B. sphaericus)
13/32
Rod Bacillus (2)
●
rozdělení dle morfologie endospor:
14/32
Bacillus anthracis
●
obligátní patogen, původce anthraxu (sněť
slezinná, uhlák)
●
plicní anthrax: spory pronikají do plicních alveolů →
makrofágy do mediastinálních uzlin (zpočátku
připomíná chřipkovité onemocnění) hemoragická→
nekróza uzlin a bakteriémie septický šok a respirační→
selhání; bez včasného podání ATB letalita až 100 %
●
kožní anthrax: papula v místě vstupu vřed se→
silným edémem a hemoragickou nekrózou v centru →
regionální lymfadenitida sepse u neléčení infekce→
●
střevní anthrax: nauzea, zvracení, horečka, bolesti
břicha, krvavé průjmy sepse; letalita až 50 %→
●
lékem volby jsou penicilinová ATB 15/32
Další druhy rodu Bacillus
●
B. cereus – součástí střevní mikroflóry, alimentární
enterotoxikózy při přemnožení; devastující infekce oka
●
B. subtilis, Geobacillus (dříve Bacillus)
stearothermophilus – spory přežívají vysoké teploty,
indikátory účinnosti sterilizátorů
16/32
Léčba infekcí způsobených
enterokoky a G+ tyčkami
●
enterokoky a listerie rezistentní na cefalosporiny
●
E. faecalis ampicilin, E. faecium je k ampicilinu
primárně rezistentní
●
ko-trimoxazol, doxycyklin, jako rezerva vankomycin
●
vankomycin rezistentní kmeny (VRE)
– zejména u hematoonkologických pacientů
– linezolid (oxazolidinony, inhibice proteosyntézy)
– quinupristin/dalfopristin (streptograminy, inhibice
proteosyntézy)
17/32
Enterokoky Listerie Koryneform. Bacillus
G+ koky
v krátkých
řetízcích
G+ tyčky,
mohou tvořit
řetízky či
palisády
G+ tyčky
skládající se
vedle sebe
(palisády,
„havraní
křídla“)
G+ robustní
tyčky,
sporulující
(nemusí být
viditelné)
šedavé,
velké asi
jako S.
agalactiae,
většinou bez
hemolýzy,
ale i s virid.
či hemol.
podobné
entero-
kokům,
hemolýza je
či není
velmi drobné
kolonie
(podobné
mouce)
plsťovité
kolonie,
někdy i
výrazná
hemolýza
Enterokoky a G+ tyčky:
přehled kultivace a mikroskopie
18/32
MikroskopieKultivace
Diagnostika enterokoků
●
biochemické testy: KAT-, štěpení arabinosy (E.
faecalis neštěpí, půda je zelená, E. faecium štěpí,
žlutá), ENCOCCUStest
●
antigenní analýza: zpravidla se nepoužívá (dle
Lancefieldové antigenní skupina D
●
citlivost lze testovat na běžném MH agaru bez krve
●
speciální půdy na skríning VRE
19/32
Diferenciální diagnostika
enterokoků
●
Gramovo barvení: grampozitivní koky, grampozitivní
tyčinky a ostatní bakterie
●
stafylokoky: KAT+, růst na agaru s 10 % NaCl
●
streptokoky: nepřítomnost růstu na Slanetz-Bartleyho
či žluč-eskulinové půdě, popř. PYR testem (kromě
S. pyogenes negativní)
●
enterokoky: růst na Slanetz-Bartleyho či žlučeskulinové
půdě, PYR test pozitivní
●
vzájemné rozlišení enterokoků arabinózovým testem
nebo složitějším ENCOCCUS testem
20/32
Diagnostika G+ tyček
●
biochemické testy: KAT+ (Arcanobacterium KAT–),
biochemicky lze rozlišovat koryneformní tyčinky
navzájem (API Coryne, Remel)
●
růst při nízkých teplotách, vysokých koncentracích
NaCl a hemolytické interakce se používají v diagnostice
listerií
●
průkaz antigenu – např. průkaz difterického toxinu
Elekovým testem
21/32
Diferenciální diagnostika G+ tyček
●
u G+ tyčinek ale není jednoznačný algoritmus!
●
Gramovo barvení: odliší grampozitivní tyčinky od
ostatních (bacily robustní tyčky, často tvorba endospor
●
bacily kultivačně charakteristické (velké plsťovité
kolonie)
●
druhové určení je možné biochemickými testy, testy
citlivosti na antibiotika apod.
●
pokud tyčky nesporulují a nejsou robustní, mělo
by jít o listerie nebo některou z koryneformních
tyček (samotná nepřítomnost endospory není důkaz!)
●
další rozlišení je možné biochemicky, růstem při
různých teplotách, testy hemolytických interakcí
(synergismů, antagonismů) apod. 22/32
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
●
obarvěte podle Grama osm kmenů
●
G+ koky, G+ tyčky, jeden kmen G– tyčka
●
Bacillus – robustní tyčinky, někdy s nálezem
centrálně až subterminálně uložených endospór, jež
mohou, ale nemusí vyklenovat tyčku
●
Listeria – mikroskopicky drobnější než Bacillus,
neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých
řetízcích
●
Corynebacterium – kyjovité, uspořádané do palisád či
„havraních křídel“
23/32
Úkol 2: Morfologie kolonií G+ koků
a tyčinek
●
popište kolonie, odhadněte rody bakterií
●
Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie,
„rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou
hemolýzou, jindy zcela bez ní
●
Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi
podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s
hemolýzou
●
Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo
bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o
hodně menší, většinou bez hemolýzy
24/32
Úkol 3: Některé běžné biochemické
a kultivační testy
●
úkol 3a: katalázový test (Listeria, Corynebacterium i
Bacillus pozitivní)
●
úkol 3b: růst na Slanetz-Bartleyho půdě (pro
enterokoky, pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale
navíc mají typickou růžovou až červenohnědou barvu)
●
úkol 3c: růst na žluč-eskulinové půdě (pro
enterokoky a listerie, pozitivní jsou černé kolonie)
25/32
medmicro.info;
prof. MVDr. Boris
Skalka, DrSc.
Úkol 4: Vzájemné rozlišení
enterokoků
●
úkol 4a: arabinózový test pro druhové rozlišení dvou
nejběžnějších druhů enterokoků (E. faecalis neštěpí,
půda je zelená, E. faecium štěpí, žlutá)
●
úkol 4b: ENCOCCUStest (vyhodnoťte podle návodu,
pouze 8 reakcí, neurčujte index typičnosti a %
pravděpodobnosti)
26/32
Úkol 5: Další metody k diagnostice
listerií
●
úkol 5a: růst listerií při 4 °C (listerie je schopna
růst při nízkých teplotách; některé druhy yersinií a
pseudomonád také.)
●
úkol 5b: demonstrace růstu Listeria monocytogenes
na chromogenní půdě (půda ALOA, modré
zbarvení všech kolonií listerií, přičemž patogenní
druhy navíc mají kolem sebe halo (odlišně zbarvené
okolí kolonie).
27/32
Úkol 5b: Chromogenní půda ALOA
28/32
HALO
modré zbarvení všech kolonií listerií, patogenní druhy
mají kolem sebe halo
Úkol 6: Vztah enterokoků a G+
tyčinek k antibiotikům
●
úkol 6a: odečtěte diskový difuzní test
●
úkol 6b: demonstrace testu citlivosti u kmene
Enterococcus faecium (k ampicilinu primárně
rezistentní)
●
úkol 6c: demonstrace kmene VRE
29/32
Úkol 7: Demonstrace Elekova testu
●
precipitace mezi toxinem z toxického kmene a
antitoxinem z papírového proužku napuštěného
antisérem
30/32
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
popsat zástupce rodu Enterococcus a hlavní klinicky
významné G+ tyčky, vč. diagnostických postupů, které
vedou k úspěšné identifikaci
●
diskutovat význam VRE, jejich diagnostické a
terapeutické možnosti
●
obecně vysvětlit princip a význam precipitace v agaru a
popsat Elekův test
31/32
Nadpis
●
text
32/32