P05
Diagnostika Pasteurellaceae
a G– nefermentujících tyček
VLLM0522c (podzim 2016)
Osnova
●
čeleď Pasteurellaceae
●
zástupci gramnegativních nefermentujících
bakterií (GNFB)
●
diagnostika Pasteurellaceae a GNFB
●
úkoly
2/39
Pasteurellaceae
●
čeleď G– tyček, většinou fakultativně anaerobní,
OXI+
●
komenzálové na sliznicích savců a ptáků, hlavně HCD
●
rody: Actinobacillus, Aggregatibacter, Haemophilus,
Pasteurella, …
●
změny v nomenklatuře: od roku 2006 nový rod
Aggregatibacter (obsahuje A. actinomycetemcomitans,
původně Actinobacillus actinomycetemcomitans a
A. aphrophilus , původně Haemophilus aphrophilus)
3/39
Pasteurella multocida
●
G– pleomorfní kokobacil,
OXI+, KAT+
●
roste na KA, neroste na ENDO
●
patogenní pro skot, ovce a drůbež;
nepatogenní pro psy a kočky →
infekce po kousnutí
●
infekce ran s komplikacemi
(abscesy, celulitida, osteomyelitida, …), pneumonie,
endokarditidy, …
●
citlivá na penicilin (u G – bakterií nezvyklé),
rezistentní na vankomycin
4/39
Rod Haemophilus
●
drobné pleomorfní G– tyčky, fakultativně anaerobní
●
kultivačně náročné, potřebují k růstu faktor X
(hemin) a/nebo faktor V (NAD)
– faktor X (hem) nutný pro funkci respiračních
enzymů, katalázy, peroxidázy apod.
– faktor V (NAD) nutný pro oxidačně redukční procesy
v buňce
– hynou při chladničkové teplotě důsledky pro→
transport a zpracování vzorků
●
na sliznicích člověka i zvířat (nosohltan), většina se
považuje za normální mikroflóru
5/39
Rod Haemophilus (vybraní zástupci)
●
Haemophilus influenzae
– pouzderný typ b (Hib) – hexavakcína
●
epiglotitidy, pneumonie, sinusitidy, faryngitidy, ...
– pouzderné typy a, c, d, e, f
●
lokalizované infekce respiračního traktu
– neopouzdřené kmeny (nízká patogenita)
●
Haemophilus parainfluenzae (běžnější a méně
patogenní)
●
Haemophilus aphrophilus (lehké infekce HCD)
●
Haemophilus ducreyi (pohlavně přenášená choroba
ulcus molle)
6/39
Ulcus molle
●
pohlavní choroba,
vyskytující se především
v subtropických a tropických
oblastech
●
ulcus molle – měkký vřed (chancroid/šankroid) –
způsoben Haemophilus ducreyi, bolestivé
●
ulcus durum – tvrdý vřed (chancre/šankr) – jeden
z příznaků syfilis, způsobené Treponema pallidum,
nebolestivé
7/39
www.fmt.am.gov.br
Skupina HACEK
●
skupina G– bakterií způsobující bakteriální
endokarditidy
●
obsahuje některé zástupce čeledi Pasteurellaceae:
– Haemophilus parainfluenzae, H. paraphrophilus
– Aggregatibacter (Actinobacillus)
actinomycetemcomitans
●
další členové jiných čeledí:
– Cardiobacterium hominis
– Eikenella corrodens
– Kingella kingae
8/39
G– nefermentující bakterie
●
nesourodá skupina G– tyček
●
neschopnost fermentovat glukózu (ale mohou ji
štěpit aerobně!)
●
nejdůležitější rody Pseudomonas, Acinetobacter,
Burkholderia, Stenotrophomonas, dále např.
Bordetella, Eikenella, Kingella, Moraxella, …
●
adaptovány na vnější prostředí, často rostlinné
patogeny (aerobní respirace, pigmentace, nižší
teplotní optimum okolo 30 °C)
●
patogenita obecně nízká (kromě oslabených osob, tj.
imunokompronitovaní, dlouhodobě hospitalizovaní,
popáleniny, ...)
●
nozokomiální infekce zejm. respiračního traktu 9/39
Pseudomonas aeruginosa
●
G– tyčky, aerobní, OXI+, KAT+, typická zelená
pigmentace (lat. aerugo – měděnka), typický zápach
po jasmínu, starší kultury po amoniaku, pestrá
biochemická aktivita
●
napadá oslabené jedince (popáleniny,
imunosuprese, jiná závažná onemocnění jako diabetes,
cystická fibróza, …)
●
zdravé lidi může kolonizovat → vektor šíření
nozokomiálních nákaz
●
nejhorší prognózy u infekcí popálenin, sepsí
novorozenců, osteomyelitidy a devastujících
infekcí oka (proteolytické enzymy)
●
časté rezistence, protipseudomonádová ATB 10/39
Pseudomonas aeruginosa (2)
11/39
Výjimečný kmen pseudomonády
s modrým pigmentem
textbookofbacteriology.net
Typický kmen pseudomonády
se zeleným pigmentem
Rod Burkholderia
●
Burkholderia cepacia
– nozokomiální nákazy (především dýchacích cest,
pacienti s cystickou fibrózou)
●
pacienti s cystickou fibrózou časté (i trvalé)
záněty dýchacích cest, nejčastěji:
– Pseudomonas aeruginosa
– Staphylococcus aureus
– Haemophilus influenzae
– Burkholderia cepacia
– Aspergillus sp.
12/39
Rod Burkholderia (2)
●
Burkholderia mallei
– vozhřivka (malleus)
– lymfadenopatie se sepsí
– výskyt u koní, oslů a ovcí
– v případě přenosu
na člověka fatální
●
Burkholderia pseudomallei
– melioidóza (pseudomalleus) – často
bezpříznakově, v případě klinické manifestace
sepse (neléčená má mortalitu 95 %)
13/39
Další GNFB
●
rod Acinetobacter (OXI–)
– A. baumannii – nozokomiální infekce, respirátorové
pneumonie, sepse
●
rod Stenotrophomonas (OXI–)
– S. maltophilia – u oslabených nozokomiální
infekce s vysokou mortalitou (časté rezistence na
ATB)
14/39
Diagnostika hemofilů a pasteurel
●
přímé metody
– mikroskopie – krátké G– tyčky
– kultivace – pasteurely nerostou na Endově
agaru (rostou Enterobacteriaceae, Vibrionaceae a
GNFB), hemofily ani na obyčejném KA,
používámě čokoládový nebo Levinthalův agar
(testy ATB citlivosti) (s výjimkou současné
kultivace s jiným mikrobem – satelitový fenomén);
typický zápach nebo citlivost k ATB
– biochemická identifikace – možné ji použít
– antigenní analýza – u hemofilů (Hib)
– detekce DNA – rutinně se nepoužívá
●
nepřímé metody se téměř nepoužívají 15/39
Satelitový fenomén
●
hemofily potřebují růstové faktory z erytrocytů
●
nejsou samy schopny je narušit narušit je může→
přítomnost dalšího mikroba (zlatý stafylokok s
hemolýzou) nebo je narušíme laboratorně
(čokoládový, Levinthalův agar apod.)
●
růst hemofila pouze okolo
stafylokokové čáry
(popř. se užívá bacitracinový
disk ve vyšší koncentraci
k odclonění ostatních bakterií)
16/39
http://phil.cdc.gov
Růst hemofilů na ČA a KA
17/39
ČA KA
Hemofily – vlevo na čokoládovém agaru, vpravo jako satelit na KA
Foto: Mikrobiologický ústav FNUSA
Vyhledávání respiračních patogenů
1) očkováno tamponem
2) očkováno kličkou
3) stafylokoková čára
4) disk BH (bacitracin pro
hemofily)
5) disk V+K (vankomycin a
kolistin pro meningokoky)
na celé naočkované ploše
pátráme po hemolytických
streptokocích (bezbarvé) a
po stafylokocích (spíše bílé
či zlatavé)
18/39
Vyhledávání respiračních patog. (2)
bacitracinový disk může být umístěn buďto na
stafylokokovou čáru, nebo cca 1 cm od ní,
používají se oba způsoby
19/39
v těchto místech hledáme hemofily
Růstové faktory hemofilů
●
specifické potřeby růstových faktorů hemofilů:
– H. parainfluenzae faktor V (NAD)
– A. (H.) aphrophilus faktor X (hemin)
– H. influenzae oba faktory (X+V)
●
používáme disky s těmito faktory:
– jeden s faktorem X
– druhý s faktorem V
– třetí se směsí X a V
20/39
Růstové faktory hemofilů (2)
21/39
Růstové faktory hemofilů (3)
22/39
H. influenzae (vlevo), H. parainfluenzae (vpravo)
Antigenní analýza hemofilů
●
dnes komerční soupravy pro analýzu
●
dříve se využívalo jevu tzv. koaglutinace se
stafylokokem, kdy aglutinát byl hustší díky navázání
stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi
23/39
koláž s použitím:
www.microbes-edu.org
Citlivost rodu Pasteurella k ATB
●
G– bakterie nejsou citlivé na vankomycin
●
vankomycin lze použít jen u G+ (všechny streptokoky a
většina stafylokoků a enterokoků je citlivá)
●
málo bakterií je citlivých na penicilin, obzvláště mezi
G– tyčinkami
●
kombinace citlivosti k penicilinu a rezistence
k vankomycinu poměrně specifická pro rod Pasteurella
24/39
Diagnostika GNFB
●
přímé metody
– mikroskopie – G– tyčky, Acinetobacter je G– kok
– kultivace – rostou na většině půd vč. KA a ENDO
(nefermentují Glc a většinou ani Lac tmavé→
zbarvení kolonií na ENDO je dané případným
pigmentem)
– biochemická identifikace – možná, ale je potřeba
použít testy, zjišťující aerobní respiraci (ne
fermentaci); nutno použít sníženou teplotu a
prodlouženou inkubaci
– antigenní analýza, detekce DNA – rutinně se
nepoužívají
●
nepřímé metody se používají zřídka 25/39
Diferenciální diagnostika GNFB
●
pseudomonády:
– typická vůně (mladé kultury)
– tvoří pigmenty (nejčastěji zelené – pigment
pyoverdin, někdy modré či rezavé), nejlépe viditelné
na MH (na KA a ENDO perleťový lesk kolonií)
– OXI+
●
ostatní nefermentující, (případně sporné
pseudomonády) rozlišíme biochemicky
– např. NEFERMtestem 24 (v kombinaci s oxidázovým
testem)
26/39
Oxidázový test GNFB
●
Pseudomonas OXI+
●
Burkholderia většinou OXI+
●
Stenotrophomonas většinou OXI–
●
Acinetobacter OXI–
27/39
NEFERMtest 24
●
pro biochemickou identifikaci GNFB užíváme
většinou Nefermtest 24 (nebo podobný jiných výrobců
●
24 reakcí (trojstrip)
●
kód se tu tvoří jiným způsobem:
– první číslice je 0 (OXI–) nebo 1 (OXI+)
– dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C
– sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro
případné další rozlišení)
28/39
NEFERMtest 24 (2)
●
do jednoho rámečku
lze vložit čtyři trojřádky
pro čtyři kmeny,
každý se identifikuje
pomocí 24 reakcí
29/39Foto: Mikrobiologický ústav, O. Z.
Citlivost GNFB k ATB
●
GNFB rostou ochotně na nejrůznějších médiích
●
pro testování i léčbu používáme poměrně silná
antibiotika, nevhodná pro léčbu infekcí způsobených
běžnými bakteriemi
– cefalosporiny 3. generace* (jen některé, tzv.
„protipseudomonádové“, jako je ceftazidim)
– protipseudomonádové peniciliny, monobaktamy
a karbapenemy* (imipenem, piperacilin/tazobactam)
– aminoglykosidy (gentamicin, amikacin)
– fluorochinolony (ciprofloxacin, ofloxacin)
– polypeptidy (kolistin)
*a jejich kombinace s inhibitory betalaktamáz
30/39
Úkol 1: Mikroskopie suspektních
kmenů
●
obarvěte kmeny podle Grama a do tabulky vepište
výsledky
●
kmen, který není G– tyčka, nebude studován v úkolech
3 až 5
31/39
Úkol 2: Kultivace na agarových
půdách
●
popište kolonie na KA, pokud na KA nerostou, popište
je na ČA
●
popište růst na ENDO
●
zhodnoťte nárůst na MH agaru (pigmentace)
32/39
Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae
●
úkol 3a: Satelitový fenomén (zakreslete a popište,
jak vypadá satelitový fenomén)
●
úkol 3b: Identifikace hemofilů podle potřeby
růstových faktorů (určete kmeny podle potřeby různých
růstových faktorů)
33/39
http://phil.cdc.gov
Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae
●
úkol 3c: Detekce kapsulárních antigenů H. influenzae
●
úkol 3d: Detekce P. multocida pomocí typického
vzorce citlivosti (citlivé k penicilinu, rezistentní k
vankomycinu
34/39
koláž s použitím:
www.microbes-edu.org
Úkol 4: Hajnova půda
Úkol 5a: Oxidázový test
●
kmen, který fermentuje glukózu (žlutá barva) označte
jako „+“, kmeny nefermentující (červená) jako „–“
●
oxidáza:
– Pseudomonas OXI+
– Burkholderia většinou OXI+
– Stenotrophomonas většinou OXI–
– Acinetobacter OXI–
●
Pseudomonas (pigment, typická vůně, OXI+)
35/39
Úkol 5b: Podrobné biochemické
testování (NEFERMtest 24)
●
vyhodnoťte předložené výsledky NEFERMtestu 24
●
kultivace 2 dny při 30 °C
●
sedmimístný kód:
– první číslice je 0 (OXI–) nebo 1 (OXI+)
– dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C
– sloupce B a A se nepočítají (používají se jen pro
případné další rozlišení)
36/39
Úkol 6: Testy citlivosti patogenů
na antibiotika
●
úkol 6a: Test pro hemofila
●
úkol 6b: Test pro pasteurellu
●
úkol 6c: Test pro pseudomonádu
●
úkol 6d: Kontrola primárních rezistencí u kmenů
burkholderie a stenotrofomonády (pouze na bočním
stole)
37/39
Úkol 7: Vztahy bakterií ke kyslíku
●
porovnejte růst bakterií v bujónech
(masopeptonový a VL bujón) kultivovaných za
aerobních a anaerobních podmínek
●
GNFB jsou striktně aerobní
●
Enterobacteriaceae fakultativně anaerobní
●
anaeroby striktně anaerobní
38/39
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
popsat nejdůležitější zástupce čeledi Pasteurellaceae a
nejvýznamnější zástupce gramnegativních
nefermentujících bakterií (GNFB), vč. diagnostických
postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
●
vysvětlit použití ATB a typické vzorce citlivosti čeledi
Pasteurellaceae a GNFB
●
vysvětlit co je satelitový fenomén a na základě čeho
vzniká
●
využít specifické růstové faktory pro rozlišení hemofilů
39/39