Klinická mikrobiologie I. praktikum č. 10 Lékařská mikrobiologie – cvičení Mikrobiologický ústav LF MU www.fnbrno.cz Výsledek obrázku pro mikrobiolog Obsah cvičení }Přirozená mikroflóra }Klinická mikrobiologie – význam }Indikace mikrobiologického vyšetření a léčby }Mikrobiologický vzorek – typ, odběr, transport }Vyplnění průvodky }Zpracování vzorku }Interpretace výsledku } } }Běžná flóra našeho těla = mikroflóra – tvořena saprofyty a komenzály. }Většinou prospěšné soužití – kolonizátoři brání osídlení sliznic patogeny. }Podílejí se na homeostáze prostředí – pH atd. }Střevní mikroorganismy pomáhají likvidovat nestravitelné zbytky a mohou tvořit některé vitamíny. Mikroflóra lidského těla }Mikroflóra se nachází především v: §Dutině ústní §Hltanu §Tlustém (a částečně i tenkém) střevě §Pochvě §Na kůži }Mikroflóra se nenachází ve: §Tkáních §Parenchymu orgánů §Krvi (!!!) §Plicích §Močovém měchýři §Děloze Mikroflóra lidského těla – výskyt }Plod – bez mikroflóry, kolonizace začíná až po narození. }První měsíce života – vývoj běžné mikroflóry (především střevní mikroflóra – změna potravy). }Ženy – změny ve skladbě mikroflóry vlivem menstruace, začátku pohlavního života, menopauzy. }Senioři – možné další změny, např. kolonizace dříve sterilního močového měchýře. Mikroflóra lidského těla – kolonizace Mikroflóra lidského těla – kolonizace }Nosní dutina – bez specifické mikroflóry (přechod mikroflóry z kůže a hltanu). }Hltan – ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů. Mnohdy obtížně kultivovatelné. }Plíce a dolní cesty dýchací – fyziologicky bez mikrobů. }Hrtan – přechodová zóna, mikroflóra podobná hltanu, jen menší množství. Mikroflóra lidského těla – dýchací cesty }Rty – přechod kožní a ústní mikroflóry. }Ústní dutina – stejné jako hltan. }Jícen a žaludek – fyziologicky bez většího množství mikrobů. }Tenké a především tlusté střevo – cca 1 kg anaerobních bakterií (viz praktikum 7), dále enterobakterie, enterokoky, kvasinky, nepatogenní améby. }Řiť – přechodová zóna střevní a kožní mikroflóry. } Mikroflóra lidského těla – trávicí cesty }Ústní dutina – velice složitý ekosystém „všeho možného“ – bakterie, usazeniny, lidské buňky... }Důležitá přítomnost biofilmu – vícedruhový, strukturovaný, výskyt aerobů i anaerobů (ty jsou zanořeny v hlubších vrstvách biofilmu). } Mikroflóra lidského těla – ústní dutina }Ledviny – normálně bez mikrobů. }Pánvičky ledvinné – normálně bez mikrobů. }Močovody (uretery) – normálně bez mikrobů. }Močový měchýř mladých a středně starých osob –normálně bez mikrobů. }Močový měchýř seniorů – i za normálních okolností může být osídlen mikroflórou, která nečiní problémy a stává se „běžnou flórou“. }Močová trubice – vnější část může (nemusí) být osídlena jednak kožní mikroflórou, jednak i specificky (viridující streptokoky, aerokoky). } Mikroflóra lidského těla – močové cesty }Za normálních poměrů nejsou mikroby: §U ženy v děloze, vejcovodech, vaječnících §U muže v prostatě, chámovodech, varlatech }Specifickou normální flóru má vagina (laktobacily, příměs různých aerobních i anaerobních mikrobů). }Vulva – přechod vaginální a kožní flóry. }U muže je specifický předkožkový vak, vedle kožní a urethrální flóry jsou tu i např. nepatogenní mykobakteria apod. Mikroflóra lidského těla – pohlavní cesty }Kůže – pro mikroby nejdostupnější, ale její osídlení mnohem chudší než v případě např. úst, pochvy či tlustého střeva. }Mikrob, který chce žít na kůži, musí snášet vyschnutí a vysoké koncentrace solí. }Na kůži se tedy normálně vyskytují §koaguláza negativní druhy stafylokoků §zlatý stafylokok – malé množství je normální §korynebakteria a příbuzné G+ tyčinky malá množství kvasinek Mikroflóra lidského těla – kůže Střevní mikroflóra – „péče“ }Rekonvalescence průjmů nebo po celkové antimikrobiální terapii (kde mohlo dojít k vybití části mikroflóry) je vhodné snažit se o obnovu normálního stavu. }Používají se jogurty (nesladké, netučné), kyselé zelí, různé preparáty (Hylac). }Prebiotika – obsahují substráty pro „dobré“ bakterie }Probiotika – obsahují přímo dobré bakterie. }Symbiotika – obsahují obojí. • Vaginální mikroflóra – „péče“ }Narušení také po antimikrobiální terapii či při infekci. }Různé „lidové rady“ – aplikace jogurtu do pochvy apod. }Skutečně účinné – prebiotické a probiotické vaginální čípky. }Důležité je nepodcenit stravu (množství cukrů). }Velký vliv hraje také hormonální hladina – např. antikoncepce. • Klinická mikrobiologie }Klinická mikrobiologie „v širším slova smyslu“ je lékařská mikrobiologie – tedy ta část mikrobiologie, která se týká mikrobiálního osídlení člověka a lidských patogenů (= obsah vaší zkoušky). }Klinická mikrobiologie „sensu stricto“ popisuje vlastní procesy mezi klinickým pracovištěm a laboratoří, jakož i organizaci vlastního laboratorního vyšetření. Je tedy orientovaná na jednotlivé orgány a systémy a tedy také jednotlivé typy vzorků. • •KLINIK •LABORATOŘ •Indikace vyšetření – zda, jaké •Vlastní provedení odběru •Transport materiálu •Rozhodnutí, jak zpracovat •Vlastní zpracování materiálu •Zaslání výsledku •Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Klinická mikrobiologie – vztahy Klinická mikrobiologie – indikace }Nutno si uvědomit, proč chci nechat pacienta vyšetřovat mikrobiologicky – změna terapie, život ohrožující stavy, epidemiologické či profylaktické indikace. }Co chci vlastně vyšetřovat – nezbytná znalost spektra patogenů a možností jejich vyšetřování. Klinická mikrobiologie – 3 typy patogenů }Patogen typu Streptococcus pyogenes – nemusím vědět, že myslím zrovna na tohoto patogena, ale musím přesně vědět, kde je jeho předpokládaná lokalizace. }Patogen typu Mycobacterium tuberculosis – musím vědět, kde patogena hledám, a zároveň i to, že hledám právě tuto skupinu patogenů – to tedy musím vyznačit na žádance. }Patogen typu Toxoplasma gondii – nemusím vědět, kde se patogen v těle nachází, ale musím vědět, že hledám právě jeho. Klinická mikrobiologie – 3 typy patogenů }Patogen typu Streptococcus pyogenes – týká se kultivovatelných bakterií a kvasinek, tedy většiny mikrobů z P01 až P06. }Patogen typu Mycobacterium tuberculosis – stále je to přímý průkaz, ale speciální postupy, při běžné kultivaci se nezachytí. Týká se zejména mikrobů z P07, P08, část P06. }Patogen typu Toxoplasma gondii – nepřímý průkaz, event. přímý průkaz virového antigenu. Týká se spirochet z P09, virů, ale i některých dalších (třeba zrovna toxoplasmy). Úkol č. 1 }Pro následující kasuistiky zkuste vymyslet vhodné řešení. Zaměřte se přitom na následující otázky: §Bude užitečné vyšetřovat? Co to přinese pacientovi? §Bude účelné zvolit empirickou léčbu, cílenou léčbu (na podkladě mikrobiologického vyšetření), nebo vůbec neprovádět specifickou léčbu a pacienta léčit jen symptomaticky? Úkol č. 1 – kazuistika a) }Pacient se zarudlou, červenou mandlí a bělavým povlakem, podezření na angínu. } 47 tonsillitis2 •http://www.medicalook.com Úkol č. 1 – kazuistika b) }Pacient s bolestivostí v oblasti obličeje, dle rtg zřejmě sinusitis, CRP vysoké (zřejmě tedy bakteriální původ), klinicky však není indikována punkce dutiny. } •http://www.drgreene.org 01 Sinusitis Úkol č. 1 – kazuistika c) }Pacient s bolestivostí v oblasti zad, dle biochemických markerů vysloveno podezření na pyelonefritidu. •http://www.bbc.co.uk 12 backpain_woman Úkol č. 1 – kazuistika d) }Pacient s prokázanou pneumonií, u kterého již bylo provedeno vyšetření sputa a nebyla potvrzena přítomnost běžných patogenů. V anamnéze práce v živočišné výrobě. •http://www.szote.u-szeged.hu 22 bronchopneumonia Úkol č. 1 – kazuistika a) – závěr }Léčba bez mikrobiologického vyšetření je vždy špatná, protože dle studií je nejméně polovina tonsilitid virová (včetně infekční mononukleózy) a studie ukazují, že klinické vyšetření nestačí ke správné diagnóze. }Nutné je mikrobiologické vyšetření, popř. použití soupravy pro detekci S. pyogenes přímo v ordinaci. }V časové tísni alespoň CRP pro ověření bakteriální etiologie. }V léčbě při prokázané etiologii Streptococcus pyogenes (nebo aspoň prokázané bakteriální etiologii pomocí CRP) použijeme penicilin }Makrolidová antibiotika pouze u alergiků! • Úkol č. 1 – kazuistika b) – závěr }Punkce není indikována ani mikrobiologicky (punktovat pacienta jen kvůli vyšetřování je nutno považovat za jeho zbytečné týrání). }Na druhou stranu není indikován ani výtěr z nosu, protože nalezené bakterie (často zlaté stafylokoky) se neshodují s patogenem přítomným v dutině (pneumokok, hemofil, moraxela). }V tomto případě lze tedy doporučit empirickou léčbu. Není-li důvod pro jinou volbu, měl by se použít amoxicilin. Úkol č. 1 – kazuistika c) – závěr }Nutné samozřejmě vyšetření moče. }Vhodné je však i hemokultivační vyšetření, které odliší systémového patogena od bakterií přítomných pouze v močovém měchýři, případně kontaminujících vzorek. }Léčba by měla být cílená. }Na rozdíl od cystitidy je při pyelonefritidě nutno volit preparáty, které se dostatečně koncentrují i ve tkáních a ne jen v moči (ne tedy například nitrofurantoin). • Úkol č. 1 – kazuistika d) – závěr }Nutný odběr srážlivé krve a vyšetření séra na možné patogeny. }Navzdory anamnéze se zřejmě bude uvažovat i o běžných respiračních patogenech ze spektra původců atypických pneumonií (viry, mykoplasmata, chlamydie). }Je však vhodné doplnit o serologický průkaz tularémie, případně dalších zoonóz (například leptospirózy; pokud by šlo např. o zootechnika pomáhajícího v Africe, pak i např. brucelóza apod.). }Tyto fáze nelze oddělit – odběr je nutno činit již se zřetelem na transport materiálu do laboratoře. }V zásadě existují tři typy vzorků: §Výtěry a stěry na tamponech. §Tekuté a kusové vzorky, zasílané v nádobkách (zpravidla sterilních). §Jiné a speciální případy, viz dále. }Nelze zapomenout na správné vyplnění průvodky. • • • } } Odběr a transport vzorku }Přednost má zpravidla zaslání tekutého/kusového materiálu před pouhým zasláním stěru/výtěru. }Existují četné výjimky: §v bakteriologii se zpravidla používá výtěr z řitního kanálu namísto kusové stolice (i když zaslání kusové stolice v zásadě není chyba). §stěr z uretry je u kapavky, ale i negonokokových urethritid (NGU) doporučován spíše než zaslání vzorku moče. • • } } Typ vzorku – tekutý či výtěr? }Suchý tampon – dnes se používá jen pro PCR a průkaz antigenu, ne pro kultivaci! } • }Amiesova půda •s aktivním uhlím – univerzální transportní půda pro bakteriologii (všechny typy výtěrů). Drátěná varianta je vhodná, pokud se potřebujeme „dostat za roh“ (stěr z rány s výběžky apod.). • } • } } Typy výtěrovek 12 PlainSwab 11 Abstrichbesteck-MEDI_SWAB •www.calgarylabservices.com, www.herenz.de }Fungi QUICK – modrý uzávěr, na kvasinky a houby } • • }Souprava C. A. T. (Candida And Trichomonas) – pouze z genitálií }Na viry } • }Na chlamydie } Typy výtěrovek •www.copanswabs.com P1010011čb 17 virus swab 18 chlamydia swab } Přehled souprav na výtěry Suchý tampon na špejli: průkaz antigenu a DNA Suchý tampon na drátku: totéž, potřebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo Tampon v Amiesu na špejli: univerzální pro bakteriologickou kultivaci (vč. anaerobů, kapavky, kampylobakt.) Tampon v Amiesu na drátku: totéž, potřebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo •Fungiquick – houby •C. A. T. – houby a trichomonády (stěry z pohlaví) •Soupravy s médiem na viry, popř. chlamydie }Odběrové nádobky se používají na kusové a tekuté vzorky. Na rozměrech fakticky příliš nezáleží, stejně tak barva uzávěru má význam jen v kontextu dodavatele. Pokud jsou dodávány např. sterilní zkumavky s červeným uzávěrem a nesterilní s bílým, je třeba se tím řídit. Pozor při změně dodavatele! }U anaerobní kultivace je lépe zaslat přímo stříkačku se speciálním uzávěrem (již tedy ne s jehlou). }Vzorky se snažíme vždy dopravit do laboratoře co nejdříve, zásadní je to však u moče – do dvou hodin. } Odběrové nádoby }Odběrové nádobky se používají na kusové a tekuté vzorky. Na rozměrech fakticky příliš nezáleží, stejně tak barva uzávěru má význam jen v kontextu dodavatele. Pokud jsou dodávány např. sterilní zkumavky s červeným uzávěrem a nesterilní s bílým, je třeba se tím řídit. Pozor při změně dodavatele! }U anaerobní kultivace je lépe zaslat přímo stříkačku se speciálním uzávěrem (již tedy ne s jehlou). }Vzorky se snažíme vždy dopravit do laboratoře co nejdříve, zásadní je to však u moče – do dvou hodin. } Odběrové nádoby • Zkumavka sérová čb otočená bez popisu • Sputovka čb otočená bez popisu • Na střevní parazity čb otočený bez popisu • Do toho se vychčije čb •Běžná zkumavka. Universální použití: srážlivá krev (serologie), moč, likvor, hnis, punktát apod.; krevní a močové katetry, menší kousky tkání… •Sputovka. Nejen na sputum, ale např. i na větší kousky tkání •Nádobka na stolice – na parazitologii. Pouze tato nemusí být sterilní! •Nádobka na odběr moče. Je lepší, když pacient močí rovnou do zkumavky, avšak zvláště pro ženy je to obtížné (nejsou-li ve sprše). Mohou tedy močit do této nádobky, a pak sestra moč přelije do zkumavky. Odběrové nádoby }Nátěr na podložní sklíčko: kapavka, aktinomykóza, přímo zaslaná tlustá a tenká kapka apod. }V kožním lékařství a v epidemiologii - otisky přímo na kultivační půdu, která je pro tento účel nalita až po okraj Petriho misky; v chirurgii otisk na filtrační papír který je pak přiložen na misku s kultivační půdou }Urikult – zvláštní způsob zasílání moče v soupravě obsahující kult. půdy; z různých důvodů se příliš neujalo. }Rychlé diagnostické soupravy – většinou založené na přímém průkazu antigenu; jednoduchá manipulace, dostupná i pro nemikrobiologický personál. Při pochybách o výsledku použít klasické zaslání do laboratoře. Jiné typy odběrů (úkol č. 3) Otisková metoda u některých typů ran }čtvereček filtračního papíru je nanesen na ránu a přenesen na kultivační půdy }Správně vyplněná průvodka je velice důležitá! }Osobní údaje: podstatné kvůli pojišťovně, ale i kvůli identifikaci, komu poslat výsledek apod. }Přesný popis materiálu a požadovaného vyšetření: §nepsat pouze „výtěr“, když není jasné, odkud §ani „stěr z rány“ nestačí (jaká rána, kde lokalizována) §katetrizovaná moč × moč z permanentního katetru §uvést, zda je požadováno např. anaerobní vyšetření §nepožadovat vyšetření, které nelze provést nebo nemá smysl (např. kultivační vyšetření u syfilis) Vyplnění žádanky }Skutečnou diagnózu, je-li více, napsat tu, která souvisí s vyšetřením, popř. všechny /např. (1) diabetes mellitus, (2) poševní výtok }Akutní / chronický stav / kontrola po léčbě. }Uvést stávající nebo uvažovanou antibiotickou terapii, případně i alergii na antibiotika. }Cestovatelská anamnéza – návrat z tropů. }Pracovní anamnéza – práce v zemědělství aj. }U serologických vyšetření datum prvních příznaků, první / druhý vzorek. }U gynekologických materiálů fázi menstruačního cyklu (a při menses raději neodebírat) . }V případě mimořádných vzorků se dohodnout, telefonicky. } Vyplnění žádanky – co uvést •Nezapomeňte vyplnit na průvodce všechna důležitá pole: }pole popisující pacienta (jméno, rodné číslo, diagnóza, pojišťovna, oddělení…) }pole popisující vzorek (typ vzorku, lokalizace, okolnosti odběru) }a všechny ostatní významné části (zejména anamnézu) Vyplnění žádanky (úkol č. 4 a) }Pokuste se zjistit, které chyby jsou přítomny. }Častou chybou je nedostatečné označení typu vzorku. }Je také chybou požadovat vyšetření, které je nevhodné (například pátrání po protilátkách tam, kde převažuje buněčná imunita a protilátky nemají diagnostický význam). Vyplnění žádanky (úkol č. 4 b) – chyby }Výtěr z rány: nedostatečné, nutné přesnější uvedení typu rány a místa na těle. }Tkáň na mikrobiologii: naprosto nedostatečné, nutno více údajů. }Výtěr z rekta na parazitologii: nelze použít výtěr, nutno poslat kusovou stolici. }Kultivace syfilis: Treponemata nelze kultivovat. Vyplnění žádanky (úkol č. 4 b) – chyby }Je dáno standardními operačními postupy (SOP). Pro každý typ vzorku je dáno v SOP, jak má být vzorek zpracován a jaké metody na něj mají být aplikovány. }Ne vždy je ovšem vše dáno SOP. Zvláště ve vzácných a mimořádných případech je na rozhodnutí zkušeného laboranta či mikrobiologa, jak vzorek zpracovat. }V důležitých případech není naprosto chybou zatelefonovat do laboratoře a domluvit se. • Zpracování vzorku }Vlastní zpracování zpravidla zajišťují laboranti, dříve se SŠ vzděláním, nyní s VOŠ nebo Bc. stupněm vysoké školy. }Postupuje se vždy přísně asepticky, aby se omezilo riziko laboratorní kontaminace. Práce v “biohazard boxu“ je zároveň i dobrou prevencí profesionálních nákaz • } Zpracování vzorku – vlastní zpracování Desf1 }Zpracování bakteriologických kultivačních vzorků obvykle zahrnuje následující: §před vlastním zpracováním se některé vzorky homogenizují, centrifugují či jinak upravují §u některých typů vzorků rychlé postupy – mikroskopie, popř. přímý průkaz antigenu §téměř vždy je základem kultivace na několika pevných půdách (KA + Endo + popř. další) §někdy též pomnožení v tekuté půdě (v případě výtěrů ze spojivky POUZE tento bod) }Zpracování jiných vzorků (serologie, PCR, mykologie, parazitologie) je speciální a je dána typem vyšetření a povahou vzorku. Zpracování vzorku – vlastní zpracování }Zpracování bakteriologických kultivačních vzorků obvykle zahrnuje následující: §před vlastním zpracováním se některé vzorky homogenizují, centrifugují či jinak upravují §u některých typů vzorků rychlé postupy – mikroskopie, popř. přímý průkaz antigenu §téměř vždy je základem kultivace na několika pevných půdách (KA + Endo + popř. další) §někdy též pomnožení v tekuté půdě (v případě výtěrů ze spojivky POUZE tento bod) }Zpracování jiných vzorků (serologie, PCR, mykologie, parazitologie) je speciální a je dána typem vyšetření a povahou vzorku. Zpracování vzorku – vlastní zpracování }Výsledek je zaslán poté, co je dokončen diagnostický proces. Někdy je poslán předběžný výsledek („mezivýsledek“) po ukončení aerobní kultivace s tím, že to, co trvá delší dobu (kultivace kvasinek, anaerobů apod.) bude případně zasláno dodatečně. }Výsledek už v sobě zahrnuje kus interpretace: mikrobiolog se vyjadřuje k evidentním kontaminacím, náhodným nálezům, běžné flóře, komentuje nález v poznámce. Zaslání výsledku }Definitivní interpretace nálezu je ovšem v rukou klinika. Pouze on, nikoli mikrobiolog, totiž drží v.rukou vedle mikrobiologického nálezu také biochemický, rentgenový, ultrazvukový, a především zná pacienta – zná anamnézu, vyšetřil jej, popřípadě (u obvodních lékařů) jej zná dlouhodobě. }Samozřejmě, konzultace klinika a mikrobiologa je u závažných případů velice vhodná. Na druhou stranu nelze konzultovat každý nález. Interpretace výsledku }Patogen – mikrob nalezený přímým průkazem může být patogenem. Není jím ale vždy. }Součást běžné flóry – důvod, proč je třeba znát normální osídlení v různých lokalizacích. }Náhodný nález (= součást transientní běžné flóry). Příklad: malá množství enterobakterií ve výtěru z krku, zvláště u ambulantních pacientů – normální. }Kolonizující mikrob – zejména u výtěrů z ran: mnohé mikroby ránu jen kolonizují. }Kontaminace během odběru, transportu apod. Interpretace přímého průkazu Interpretace přímého průkazu – úkol 5a Nález Pravděpodobně je to Streptococcus pyogenes ve výtěru z krku patogen Neisseria lactamica ve výtěru z krku běžná flóra Escherichia coli (významné množství) v moči patogen Escherichia coli ve stolici běžná flóra Bacillus sp. ve stěru z kůže kontaminace Staphylococcus epidermidis ve stěru z kůže běžná flóra Staphylococcus epidermidis opakovaně ve vzorku z krevního řečiště patogen Interpretace přímého průkazu – úkol 5a Nález Pravděpodobně je to Pseudomonas aeruginosa v ráně, kde byl zároveň nalezen Streptococcus pyogenes kolonizace (streptokoka léčit celkově, pseudomonádu jen lokálně) Entamoeba histolytica ve stolici patogen Entamoeba coli ve stolici náhodný nález Aspergillus sp. v malém množství v kožní šupině kontaminace z prostředí Trichophyton mentagrofytes v kožní šupině patogen Rotavirus ve stolici patogen }Akutní infekce – charakterizována pozitivitou IgM protilátek, čtyřnásobným vzestupem titru, nízkoavidními protilátkami. Avšak někdy ani to vše nestačí – může např. jít o zkříženou reaktivitu. }Nemoc v minulosti – zpravidla pouze IgG pozitivita a nízký, neměnící se titr. Bohužel ani zde ne vždy jednoznačně platí. }Chronická nemoc – někdy velmi obtížná interpretace. U hepatitidy B je velký rozdíl mezi jednotlivými formami chronické hepatitidy. Interpretace nepřímého průkazu Klinická situace Výsledky serologie Interpretace Těhotná žena bez problémů Toxoplasma IgG +, IgM –, KFR pozitivní, titr 1 : 10 opakovaně Není nyní nakažena, zřejmě infekce dříve, má výhodu, protože je chráněna Senior s příznaky toxoplasmové retinitidy Toxoplasma IgG –, IgM –, KFR negativní Vzhledem k příznakům nelze infekci vyloučit. Je nutné další vyšetřování Pacient se žloutenkou VHA a VHC kompletně negativní, HBsAg, HBeAg a anti-HBc igM pozitivní Akutní hepatitida B Jiný pacient se žloutenkou VHA kompletně negativní, anti-HBs, anti-HBe a anti-HCV IgM pozivitní Akutní hepatitida C; hepatitida B v minulosti Pacient s erythema migrans Protilátky proti borreliím kompletně negativní Nutná léčba, možná příliš čerstvá infekce Interpretace nepřímého průkazu – úkol 5b