Fluorescenční in situ
hybridizace - postup
Materiál
→ v naší laboratoři se zpracovává:
• kultivovaná kostní dřeň
• kultivovaná periferní krev
• kultivovaná plodová voda
• nekultivované amniocyty
• otisky kostní dřeně a tumoru
Denaturace a renaturace
zhotovení kvalitního preparátu obsahující cílové místo (metafázní
chromozómy, interfázní jádra, tkáňové preparáty, celé buňky)
.příprava a značení sond
.denaturace sondy
.denaturace cílového místa
.hybridizační reakce mezi sondou a cílovým místem
.odstranění nenavázané či nespecificky vázané sondy
…..barvení pozadí
…….vyhodnocení a zpracování fluorescenčního signálu
nakapaná sklíčka – suspenze jader po kultivaci
zestaršení preparátů
v roztoku 2xSSC při
37OC
dehydratace skel vzestupnou alkoholovou řadou
sušení zestaršených skel pod větráčkem
komerčně dodávané sondy
sklo s nakapanou suspenzí sonda
sklo s nakapanou suspenzí + sonda dohromady
orámování preparátu chemoprénem
denaturace DNA a sondy
teplota závisí na typu sondy (75°C)
(přítomný formamid snižuje teplotu denaturace)
vložení skel do vlhké komůrky
- v termostatu pak probíhá sekvenčně specifická hybridizace
inkubace skel přes noc (1-2 dny) při 37OC
odmytí preparátů v 0,5xSSC - 4 min při 73OC
oplach preparátů v 2xSSC
sušení preparátů ve tmě (v šuplíku☺ )
celochromosomové sondy
Lokus specifické sondy