Izolace buněk Funkční testy lymfocytů Izolace PBMC PBMC = peripheral blood mononuclear cells = lymfocyty, monocyty • Izolace PBMC pomocí gradientové centrifugace krev se opatrně navrství na separační médium při centrifugaci se oddělí jednotlivé vrstvy na základě odlišné vznášivé hustoty – nahoře je plazma, mezi plazmou a médiem je vrstva PBMC, na dno klesnou erytrocyty a granulocyty Izolace PBMC • odebere se plazma • poté se nabere vrstva PBMC pozorovatelná jako bílý prstenec na rozhraní plazmy a média • PBMC se pak promyjí pomocí PBS (opakované stočení, odlití supernatantu a rozsuspendování peletu v PBS) • získá se koncentrovaná suspenze mononukleárů Další typy izolací buněk • Jednotlivé typy leukocytů je možné izolovat např. pomocí IMUNOMAGNETICKÉ SELEKCE • Využívá magnetické kuličky s navázanými monoklonálními protilátkami proti určitým CD znakům hledaného typu buněk • buňky se navážou na tyto kuličky a jsou silným magnetem přichyceny ke stěně zkumavky, po odmytí ostatních buněk zůstanou jen požadované buňky (pozitivní selekce) • postup je možné využít i obráceně – zbavit se určitého typu buněk a získat všechny ostatní (negativní selekce) • k izolaci buněk je možné využít i modifikaci průtokového cytometru – cell sorter Funkční testy lymfocytů • Patří sem zejména TEST PROLIFERACE LYMFOCYTŮ, kdy se sleduje schopnost dělení lymfocytů po stimulaci • Stimulátory: – rostlinné - PHA (fytohemaglutinin), ConA (konkanavalin) – monoklonální protilátky proti receptorům a koreceptorům (anti-CD3, anti-CD28) – bakteriální antigeny – tetanický toxoid • Izolované buňky se kultivují několik dní in vitro s různými stimulátory a pro kontrolu i bez stimulace • Poruchou proliferace se vyznačují závažná onemocnění imunitního systému jako SCID (severe combined immunodeficiency) Funkční testy lymfocytů • Schopnost proliferace je možné testovat různými metodami, např: – detekce nově syntetizované DNA pomocí BrdU (bromdeoxyuridin), který je homologem thyminu a začlení se do nově vznikající DNA, BrdU je poté detekován pomocí protilátky anti-BrdU značené např. fluorescenčně – detekce nově syntetizované DNA pomocí thymidinu značeného radioaktivně (tritiem) – měření na beta- counteru – cytometrická detekce pomocí fluorescenčního barviva CFSE (karboxyfluoresceinsukcinimidylester), které se váže nespecificky na různé struktury v buňkách, sleduje se nárůst fluorescence po dělení buněk Kultivace lymfocytů in vitro • pěstování probíhá v definovaném bazálním médiu – obsahuje cukry, AMK, vitamíny, stopové prvky atd. (+ATBpenicilin, streptomycin…) při 37°C, 5%CO2, 95%vlhkost • normální buňky mají omezenou délku života – omezený počet dělení • pomocí karcinogenních látek či virů (SV40, EBV) lze dosáhnout transformace buněk na nesmrtelné a vytvořit tzv. buněčné linie Jurkat – lidské leukemické buňky produkující IL-2 HL-60 – lidské buňky odvozené od myeloidních leukemických bńěk • cesta kterou objeveny mnohé fce cytokinů a růst. faktorů ELISPOT • patří mezi funkční testy lymfocytů • slouží ke sledování produkce specifických protilátek • B-lymfocyty nebo prokdukce cytokinů T- a B-lymfocyty ELISPOT 5 x 105 2,5 x 105 1,25 x 105 0,63 x 105 7 dní po očkování SCID severe combined imunodeficiency • skupina onemocnění, které vykazují vadu ve vývoji lymfoidní řady – někdy pouze porucha vývoje T-lymf, někdy kombinace s B-lymf. a s NK buňkami (záleží na genetické vadě) • klinické projevy - thymus se nevyvíjí normálně (úplně/redukce), velmi nízké počty cirkulujících lymfocytů (lymfopenie) a T-lymfocytů • lymfocyty nereagují na stimulaci mitogeny – tzn. nemůžou proliferovat v odpovědi na antigeny (myeloidní a erytroidní řada je v počtech a funkci neovlivněna) SCID • existuje asi 7 variant, které jsou AR, jedna X vázaná • většinou jde o defekt v gama řetězci IL-2R (X-vázaná forma), tento řetězec je součástí i receptorů IL-4, -7, -9, 15 Syndrom T-bb B-bb NK-bb Dědičnost Retikulární dysgeneze - - - AR ADA deficit - - - AR RAG 1,2 deficit - - + AR CgC deficit - + - XL JAK3 deficit - + - AR IL-7Ra deficit - + + AR Omennův syndrom + - + AR ZAP-70 deficit CD4+ + + AR SCID • prodloužení života vyhnutím se kontaktu s potenciálně nebezpečnými patogeny – musí žít ve sterilním prostředí! • musí se vyhýbat kontaktu s lidmi a nefiltrovaným vzduchem, vše s čím přijdou tyto děti do styku - včetně jídla! musí být sterilizováno