Patogeneze mnohočetného
myelomu
Doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D.
Babákova myelomová skupina
ÚPF LF MU
Monoklonální gamapatie
 Abnormální proteiny v séru nebo v moči
 Tyto proteiny jsou produkovány klonem plazmatických
nebo lymfoidních buněk
 MGUS
 Mnohočetný myelom
 Plasmocelulární leukémie
 Primární amyloidóza
 Solitární plazmocytom
 Waldenströmova makroglobulinémie
World Health
Organization
Adam, 2011
Hematopoéza
Plazmatické buňky
 Druh bílých krvinek zodpovědných za tvorbu protilátek
 Obvykle 5% v kostní dřeni
 U MM nádorově změněny
 Vytvářejí monoklonální imunoglobulin = paraprotein
Protilátky
 Rozeznat a zneškodnit cizí objekty v organismu.
 Eliminace daného patogenu
 Funkce: opsonizace (vede k fagocytoze), neutralizace,
tvorba komplexů
 IgG, IgA, IgM, IgE a IgD
Protilátky třídy IgG jsou schopné pronikat do tkání a
jako jediné během těhotenství prostupují placentou
do těla plodu.
Protilátky třídy IgA vznikají hlavně ve sliznicích
(střeva a dýchacích cest) a zabraňují průniku
mikroorganizmů do těla.
Protilátky třídy IgM se tvoří jako první během
infekce. Zajišťují tak ochranu organizmu během
prvních dní, než se vytvoří ostatní typy protilátek.
Protilátky třídy IgE se účastní hlavně při obraně
proti cizorodým parazitům a účastní se alergických
reakcí.
Funkce protilátek třídy IgD je stále nejasná.
Základní struktura imunoglobinu
MGUS
 Prekarcinóza
 V populaci nad 50 let: 3-4 %
 Riziko progrese do MM: 1 % ročně
Mnohočetný myelom
 Druhé nejčastější krevní nádorové onemocnění
 10 % hematologických malignit
 Věk při diagnóze 65 let
 Incidence 4/100 000
 Častější u mužů
 MGUS prekanceróza
 Infiltrace kostní dřeně PB
 Kostní léze
 Přítomnost M-Ig v séru a/nebo moči
Hájek, 2012
Anderson, 2011
PCL
 Nejagresivnější forma MG
 Incidence 0,04/100 000
 Více než 20 % cirkulujících plazmatických buněk a více
než 2x109/L
 Medián při diagnóze - 52 let
 Medián přežití 1,5 roku, ale i méně
Primární amyloidóza
 Amyloidové depozity v orgánech
 Produkce abnormálních proteinových filament
 Raritní onemocnění
 Může doprovázet MM
 Přežití cca 40 měsíců
Solitární plazmocytom
 Solitární leze abnormálních plazmatických buněk
 Bez postižení kostní dřeně
 Bez postižení skeletu nebo CRAB symptomy
 Riziko progrese do MM – 10 % za 3 roky
Waldenstromova makroglobulinémie
 Postižení lymfocytoplazmoidních buněk (znaky
plazmatických buněk ale i lymfoidních)
 Produkce velkého množství IgM
 Velice raritní
Mnohočetný myelom
Historie MM
Capasso, 2005
Mužská lebka z doby bronzové s charakteristickými
rysy mnohočetného myelomu
Historie MM
 1844 - první zdokumentovaný případ – Sarah Newbury
(Dr. Solly)
Kyle et Rajkumar, 2008
destrukce sterna zlomeniny kostí destrukce femuru
Historie MM
 1845 – přítomnost proteinu v moči pacienta (Bence
Jones – Bence Jonesova bílkovina)
 Kahlerova choroba – podle pražského lékaře Otty
Kahlera
Kyle et Rajkumar, 2008
Patogeneze MM
 Několikastupňový proces
Špička, 2005
Zdravá kostní dřeň MM kostní dřeň
www.pathologyatlas.com
Mnohočetný myelom
klinická část
(doc Minařík FNOl)
Příčiny MM
 Příčina není přesně známa
 věkem podmíněný pokles imunity
 nahromadění „nepříznivých vlivů“ v průběhu života
 hormonální změny
 vliv chemických látek
 radiační záření
  změny vedoucí k nestabilitě genetické výbavy
plazmatických buněk
 Nejde o onemocnění nakažlivé ani přenosné
Projevy
 1) útlum kostní dřeně:
  červených krvinek  anemie
  bílých krvinek  pokles imunity
  destiček  krvácivé projevy
Projevy
 2) Narušení kostní struktury: tvorba osteolytických
ložisek:
 oslabení pevnosti kostí
 bolest, zduření kostí
 samovolné zlomeniny kostí
 vzestup vápníku v séru
Projevy
 3) Tvorba defektních imunoglobulinů - Ig (paraproteinu):
 zhoršení vlastností krve – „hyperviskozita“
 střádání paraproteinu v drobných cévách - porucha funkce
orgánů (ledviny, porucha zraku, …).
 pokles imunity – paraprotein na úkor normálních Ig
Diagnóza
 Poměrně obtížná (bolest, slabost, nevýkonnost,
opakované infekce, únavový syndrom – časté příznaky
„běžných“ onemocnění)
1) Počet myelomových buněk v kostní dřeni
2) Přítomnost abnormální bílkoviny v krvi/moči
3) Typické změny na kostech
Vyšetřovací metody
 Rozbor krve a moči – elektroforéza (ELFO) analýza
proteinového spektra
 Odběr a vyšetření kostní dřeně
 Rentgenové vyšetření rozsahu postižení, event. CT a MR,
PET, kostní densitometrie
Nezřídka na MM upozorní  sedimentace, změny v krevním
obraze, vždy však nutno doplnit uvedená vyšetření.
Vyšetřovací metody - obecné
 Škála doplňujících „nepřímých ukazatelů“:
 Sedimentace
 Krevní obraz
 Hladina vápníku
 Ledvinné funkce (urea, kreatinin)
 Hodnoty normálních protilátek (imunoglobulinů)
 Testy jaterních funkcí
 Hodnocení kostního metabolismu
Vyšetřovací metody - speciální
 Beta-2-mikroglobulin
 Cytogenetické vyšetření
 Imunofenotypizace povrchových znaků MM buněk
 Proliferační charakteristiky MM buněk
 Angiogenní cytokiny
 Vyšetření párů lehkých/těžkých řetězců
 Albumin
 …+ nové systémy stážování
Hodnocení závažnosti a průběh
 3 stádia pokročilosti onemocnění
 I-III určují závažnost postižení organismu
 A/B normální/zhoršená funkce ledvin
 Průběh
 Rozmanitý, individuální
 Škála od „laboratorní formy nemoci“ po samovolné
zlomeniny obratlů s útlakem míchy, selhání funkce ledvin,
závažná infekční onemocnění, krvácivé stavy
Léčba MM
 Pomerančová kůra, rebarbora a opiáty
 Chemoterapie
 Transplantace
 Imunomodulační léky
 Inhibitory proteasomu
Hájek, 2012
Anderson, 2011
Prognóza MM
 Neléčení pacienti přežívají 14 měsíců
 Standardní terapie 3-4 roky
 Transplantace 6-7 let
 Nové léky 5-leté přežití pro cca 80 % pacientů
Hájek, 2012
Chemoterapie a transplantace
 Používaná i dnes
 Léčebný program Junior-Senior
 Melfalan
 Alkylační cytostatikum
 Prednison
 Glukokortikoid – apoptóza hematologických buněk
 Transplantace od roku 1957
 Autologní – do 65 let, i tandemově
 Allogenní – omezeně, jen v rámci klinických studií
Hájek, 2012
Anderson, 2011
Možnosti léčby MM
 IMIDs
 Proteasomové inhibitory
Možnosti léčby MM
 IMIDs
 Proteasomové inhibitory
Thalidomid
 1953- Chemie Grünenthal
 1957- distribuce
 Sedativum, hypnotikum
 Proti ranní nevolnosti u těhotných žen
 Těžký teratogen
 Nebyl dostatečně otestován – jen na krysách
 Zhruba 10 000 dětí takto narozených - zhruba 40 %
dětí přežilo
 FDA - Dr. Francis Kelsey
Sedlaříková, 2012
White House Archive
Thalidomid
 1964 – Jason Sheskin – pacient s leprou a těžkými
komplikacemi
 1993- Judah Folkman – angiogeneze, solidní nádory ale
i hematologické
 1994 – refrakterní MM pacient – thalidomid – klinická
studie 1/3 pacientů odpověď
 2006 – FDA – léčba MM
 Nepříjemné vedlejší účinky - neuropatie
Sedlaříková, 2012
 Analogy thalidomidu – lenalidomid a pomalidomid
 Významný posun v léčbě MM
 Pleiotropní účinky proti MM:
 Kostimulace T-lymfocytů
 Antiangiogenní účinky
 Protizánětlivé účinky
 Inhibice osteoklastů
 Apoptóza a zástava BC MM
 Inhibice interakcí mezi buňkami MM a buňkami KD
IMIDs imunomodulační léky
Sedlaříková, 2012
Možnosti léčby MM
 IMIDs
 Proteasomové inhibitory
Možnosti léčby MM
 IMIDs
 Proteasomové inhibitory
Inhibitory proteasomu
 Úspěšná léčebná strategie MM posledních 10 let
 Nádorové buňky citlivější k inhibici proteasomu
 Zvýšená proliferace
 Zvýšené nároky na syntézu proteinů a jejich degradaci
 Ovlivňují:
 Expresi transkripčního faktoru NF-κB
 Zástavu buněčného cyklu
 Indukci apoptózy preferenčně u MM buněk
 Indukují ER stresové odpovědi
Kubiczková, 2014
Efekt inhibitorů proteasomu na
mikroprostředí KD
 Vliv na přežití
 Cílí signální dráhy
vedoucí k apoptóze
 Inhibují adhezi buněk
MM a mikroprostředí
KD, angiogenezi a
interakce
zprostředkované
cytokiny
Kubiczková, 2014
Nové léky prodlužují přežití, ale ne
k vyléčení
Thalidomid (Myrin) Bortezomib (Velcade) Lenalidomid (Revlimid)
Carfilzomib ˃ Bortezomib Carfilzomib+Revlimid˃ Revlimid
 Nové inhibitory proteasomu:
 carfilzomib (Kyprolis)
 ixazomib (Ninlaro)
 Monoklonální protilátky:
 daratumumab (Darzalex)
 elotuzumab (Empliciti)
 Perspektivy pro nové nemocné:
 časnější diagnostika → časnější léčba (před
vznikem komplikací - kritéria z roku 2014)
 kombinace nových léků
Nové léky = nová naděje
Co lze koupit za 1 rok léčby:
Myrin
Velcade/
Bortezomib
Revlimid
Imnovid
Rozdíly v léčbě
Před léčbou
Léčba
Po léčbě
ostatní MM
Mnohočetný myelom
molekulární část
Patogeneze MM
 Zatím neznámá
 Genetické predispozice – příbuzní až 6x vyšší riziko
 Expozice - pesticidy, herbicidy, ionizující záření
 Mutace v PB
 Změny v mikroprostředí KD – podpora růstu PB
Hájek, 2012
Anderson, 2011
Patogeneze MM
Cytogenetické
změny a mutace Dysregulace cyklinů,
onkogenů a
nádorových
supresorů
Ztráta
imunitního
dohledu
Immunosuprese
Cytokiny a růstové
faktory
DC
Cytokiny a
růstové faktory
Hájek, 2014
Flowcytometrie
 Diagnóza MM - CD19-CD56+CD38+CD138+
 Riziko progrese MGUS (% klonálních PB)
 Detekce MRD – vyšší PFS i OS u pacientů s MRDHájek,
2012
Anderson, 2011
Říhová, 2013
Cytogenetické aberace u MM
 Nestabilní genom – delece, amplifikace, translokace
 Změny se kumulují v čase
 Numerické a strukturní změny chromozomů
 Aneuploidie lichých chromozomů a translokace lokusu
pro IgH
Palumbo, 2013
Anderson, 2011
Kuglík, 2012
Němec, 2012
Numerické aberace u MM
 Non-hyperdiploidní (48 < >74 chr.) x hyperdiploidní
(48-74 chr.)
 Hyperdiploidní:
 trisomie chromozomů – 3,5,7,9,11,15,19,21 – lepší prognóza
 Non-hyperdiploidní:
 monosomie 8,13,14,16,17,22
Palumbo, 2013
Anderson, 2011
Kuglík, 2012
Němec, 2012
Strukturní aberace u MM
 Translokace lokusu 14q32 (IgH)
 Primární změny:
 t(11;14) 15-20 % cyklin D1
 t(4;14) 10-15 % FGFR3/MMSET
 t(14;16) 2-10 % c-MAF
 t(6;14) 5 % cyklin D3
 Sekundární změny:
 Komplexní karyotypové změny v oblasti MYC
 Delece nebo duplikace chr. 1 (1q21)
 Delece nebo monozomie chr.13
 Delece chr. 17 – delece TP53 Palumbo, 2013
Anderson, 2011
Kuglík, 2012
Němec, 2012
FISH
 Většina MM buněk zastavený cyklus – není možné
použít klasickou cytogenetiku
 i-FISH – výrazně lepší výsledky
 Spojení s prognózou pacientů – t(4;14), t(14;16),
t(14;20) a del (17p) – špatná prognóza
Kuglík, 2012
Němec, 2012
Bešše, 2015
Vyšetření
 Nutná vyšetření kostní dřeně
 Bolestivé, eticky nemožné opakovat tak často, jak by
bylo potřeba
 Potřeba nového markeru? Jiný způsob?
Používané markery
 Diagnostické
 Prognostické – faktory ovlivňující přežití pacientů
 Věk
 Nádor – proliferační index, genetické aberace
 Staging nádoru
 Prediktivní – poskytne informaci o účinnosti konkrétní
léčby a pravděpodobnost odpovědi na léčbu
 dávka je ovlivněna renální funkcí a věkem
Chng, 2014
Dobrý marker musí být
 Snadno dostupný
 Minimálně invazivní
 Stabilní
 Snadno měřitelný
 Dostatečně sensitivní a specifický
 Reproducibilní mezi laboratořemi
 Použitelný pro všechny nebo většinu pacientů
 Zaměřili jsme se na tzv. tekuté biopsie
Proč se zajímat o tekuté
biopsie?
Limitace klasické biopsie
 Invazivní
 Bolestivá
 Odběr jedné oblasti nádoru – není reprezentována
celá jeho heterogenita
 Zejména u MM – přítomnost subklonů v různých
fokálních ložiscích
Tekuté biopsie
 Biopsie z periferní krve
 Detekce cirkulujících nádorových buněk
 Detekce cirkulujících nukleových kyselin
 Jednodušší odběr vzorku
 Celá heterogenita nádoru
Tekuté biopsie
Crowley et al 2013
zdravá tkáň
zánět
nádor
Cirkulující PC (cPC)
 Prognostický marker
 Ztráta závislosti na mikroprostředí KD
 Změny exprese adhezivních molekul, chemokinů ale i
počtu aberací
 Rychlejší progrese MGUS do MM
 U MM – vyšší infiltrace KD
 Negativní prognostický faktor u refrakterního MM
 Granell et al – 428 MM pts
 5-20 % cPC – horší přežití bez ohledu na věk
 > 5 % cPC – prognóza jako PCL
Jaké molekuly lze analyzovat?
KO suplementum 2017
Nekódující molekuly RNA ?
 Jen zhruba 1,5 % lidského genomu kóduje proteiny
 Více než 90 % je ale transkripčně aktivní
 Nejznámější nekódující RNA (ncRNA): rRNA, tRNA
(Sana, 2012; upraveno)
 Základní rozdělení ncRNA:
 Krátké ncRNA < 200 bp < Dlouhé ncRNA
Cirkulující ncRNA
 Tělní tekutiny
 Stabilní a odolné k
účinkům RNáz
 Snadno dostupné
 Mezibuněčná
komunikace
 Souvislost s nemocí
 Diagnostika nemoci
 Monitorování relapsu
 Monitorování MRD
http://circresearch.com/gallery/tag/circulating-mirna/
Nové markery pro MM
 MikroRNA
 Cell-free DNA
 LncRNA
Nové markery pro MM
 MikroRNA
 Cell-free DNA
 LncRNA
mikroRNA
 Krátké nekódující molekuly RNA
 20-22 nt dlouhé
 Post-transkripční regulace genové exprese
 Fyziologické procesy (proliferace, diferenciace…)
 Tumorigeneze
Lee, 1993
Calin, 2002
Historie miRNA
 Identifikovány v roce 1993 u C. elegans
 Lin-4 – larvální stádia C. elegans
 Zhruba 1/3 lidských genů je regulována miRNA
 Kolem 2200 lidských miRNA
Lee, 1993
Calin, 2002
miRNA u hematologických malignit
 miR-15a a miR-16 identifikovány v oblasti 13q14 –
potenciální onkogeny u CLL
 Expresní profily miRNA u buněčných linií, PB ve
srovnání se zdravými dárci
 První publikace Picchiori
 48 miRNA se změněnou expresí u MGUS proti ZD
 96 miRNA se změněnou expresí mezi MM a MGUS
Calin, 2002
Masri, 2005
Picchiori, 2008
Cirkulující miRNA
http://circresearch.com/gallery/tag/circulating-mirna/
Exozomy
 50-140 nm vezikuly
 Proteiny, NK
 Aktivní sekrece z buněk
 Mění genovou expresi,
signalizaci v buňkách
 Udržují resistenci k
chemoterapii (odvádějí
chemo mimo buňku)
 Podporují tumorigenezi –
předávání miRNA
Cirkulující miRNA u MM
 Jones et al, 2012
 Cirkulující miRNA v séru MM pacientů vs MGUS vs ZD
 Potenciální biomarkery u MM: miR-720, miR-1246 a
miR-1308
Jones, 2012
Exozomálních miRNA u MM jako
prognostické faktory
 miRNA nejvíce zastoupená skupina molekul v
exozomech (procesovat premiRNA na miRNA)
 156 MM pacientů při diagnóze sekvenací i qPCR
 let-7b, miR-155, miR-18a – PFS
 let-7b and miR-18a - OS
Manier et al 2016
Naše pilotní studie
 Vybrány 4 miRNA v souvislosti s patogenezí MM
 Jejich přítomnost ověřena v séru 91 MM pacientů
 miR-410 – lokus 14q32 – MM translokace
 miR-660 – aberantní exprese spojená s MM
 miR-142-5p – aberantní exprese spojená s MGUS a MM
 miR-29a – zvýšená exprese u MM PB
Ševčíková, 2012
Výsledky pilotní studie
 miR-29a zvýšena u MM
 Specificita 70 %, sensitivita 88 %, AUC=0,832
Ševčíková, 2012
Cirkulující miRNA jako MG markery
 MM, MGUS a ZD
 103 MM při diagnóze
 18 MM v relapsu
 57 MGUS
 30 ZD
Kubiczková, 2014
Metody
TaqMan Low
Density Arrays
Analýza rozdílně
exprimovaných miRNA
qPCR
Specific TaqMan miRNA assaysAnalýza dat
Izolace miRNA
Korelace s klinicky
významnými
parametry
Cirkulující miRNA jako MG markery
 miR-744, miR-130a, miR-34a, let-7d, let-7e
deregulovány u MG pacientů ve srovnání se ZD
 Kombinace miR-34a a let-7e: MM vs ZD vs MGUS
(sensitivita i specificita > 89 %), ale nejsou
samostatné prognostické markery
 Není korelace s PB v KD – jiné patologické změny u
MM
Kubiczková, 2014
Nízké hladiny miR-744 a let-7e spojeny
s kratším přežitím
Kubiczková, 2014
Extramedulární relaps
 Poprvé opublikován v roce 1948
 PB mimo kostní dřeň
 Sekundární mutace – PB nezávislé na mikroprostředí
 Primární vs sekundární EM
 Spojený s kostí nebo infiltrace do měkkých tkání
 Zvýšená incidence?
 Nové léky ovlivňují mikroprostředí kostní dřeně
 Lepší detekce PET/CT
Usmani, 2013
Pour, 2014
EM relaps- klinická zkušenost
 Analýza 226 relabovaných MM pacientů
 EM u 24 %
 14 % do měkkých tkání (EM-S)
 10 % spojeno s kostí (EM-B)
Pour, 2014
Přežití EM pacientů
Pour, 2014
Přežití 2 skupin EM pacientů
Pour, 2014
P=0.006
Můžeme použít cirkulující miRNA
jako markery EM?
EM miRNA projekt
 Sérum periferní krve
 55 EM pacientů – 5 primárních, 50 sekundárních
 59 MM pacientů – 49 při diagnóze, 10 v relapsu
 30 ZD
Bešše, 2015
Testovací kohorta
 35 EM, 35 MM, 30 ZD
 miR-195 - nesignifikantní, vyřazena
 miR-222 – vyšší v EM vs ZD
 miR-34a – rozdíly MM vs EM a ZD
 miR-130a – rozdíly MM vs EM a ZD
Bešše, 2015
Validační kohorta
 20 EM (2 primární EM, 18 sekundární EM)
 24 MM (14 při diagnóze, 10 v relapsu) – PET/CT
 miR-34a nerozlišila EM vs MM
 miR-130a snížena (p=0,012)
 Sensitivita a specificita poměrně nízká
Bešše, 2015
miR-130a – mezibuněčná komunikace?
Bešše, 2015
Co víme o miR-130a?
 Účastní se patogeneze CML, glioblastomu, ovariálního
karcinomu
 Buňky se sníženou hladinou – snížená proliferace,
změna v BC, změna v maturaci
 Naše předchozí práce – snížena u MG vs ZD
 Proangiogenní vlastnosti
 Spojené s EM tumorigenezí?
 Hladina snížena v PB v KD u EM pacientů ve srovnání s
PB v KD u MM, ale zvýšena u PB v nádoru (p=0,001)
Bešše, 2015
A co cirkulující miRNA v moči?
Cirkulující miRNA v moči
 Opravdu neinvazivní marker
 Identifikovány u renálního karcinomu
 Ledviny postiženy u MM
 Existují miRNA, které umožní diagnostiku MM z moče?
 NE, alespoň v našich rukách
Slabý, 2014
Mlčochová, 2014
Sedlaříková, 2015
Cirkulující miRNA v moči
 85 vzorků – MM, ZD, RCC
 20 deregulovaných miRNA
v první fázi
 8 vybráno pro validaci
 Není statisticky
signifikantní
 Profil není specifický pro
MM, ale pro poškození
ledvin
Sedlaříková, 2015
Shrnutí – cirkulující miRNA
 Velký potenciál
 Možný marker MM i EM
 U EM – můžeme identifikovat pacienty, kteří mají
zvýšené riziko vzniku EM, již při diagnóze?
 Ověření miR-130a jako markeru
 Cirkulující miRNA z moče nespecifické
 Stále nevíme
 Odkud cirkulující miRNA pocházejí, z jakých tkání?
 Účastní se přímo patogeneze MM?
 A co miR-130a?
Nové markery pro MM
 MikroRNA
 Cell-free DNA
 LncRNA
Cell-free DNA
 Krátké fragmenty DNA (180 bp) v periferní krvi
 Popsány v roce 1949 (Mandel et Métais)
 1977 – popsány u pacientů s nádory (Leon et al)
 Vyšší hladiny u pacientů než u kontrol
 Vyšší hladiny u pacientů s metastázami
 Snížené hladiny po radioterapii u 66-90 % pacientů
 1994 – popsány cfDNA s mutací RAS u MDS
 Využití v prenatální diagnostice
Hladiny cfDNA
 Fyziologicky velmi nízké (10-100 ng/ml)
 U patologických stavů změna kvality a kvantity
 Vyšší hladiny (1000 ng/ml) u malignit, autoimunitních
onemocněních, zánětů aj. – nutné rozlišit zdravou cfDNA
od patologické
http://biomarkerinsights.qiagen.com/2016/08/17
Jak se dostanou cfDNA z buněk?
 Apoptóza
 Nekróza (nádorové buňky)
 Aktivní sekrecí (signalizace mezi buňkami a tkáněmi)
Schwarzenbach et al 2014
Sledování dynamiky cfDNA u MM
 Sledování pacientů do CR (+6) nebo 2 roky
 Detekce VDJ přestavby těžkého řetězce imunoglobulinu
(nádorový marker MM)
 Analýza oblasti specifické pro každého pacienta
 Detekce majoritního klonu myelomových buněk
 Analýza cfDNA nesoucí daný nádorový marker
Schéma pro jednoho pacienta
Vzorek při diagnóze
detekce klonu v KD
Léčba
Vzorek po léčbě
Schéma pro jednoho pacienta
Vzorek při diagnóze
detekce klonu v KD
Detekce daného klonu v cf-DNA
Léčba
Vzorek po léčbě
detekce daného klonu v cf-DNA
Co jsme zatím zjistili?
 Do studie zařazeno 81 MM pacientů při diagnóze
 Vyřazeno 26 pacientů – přestavba nestanovena
 Sledujeme 55 pacientů
 Zanalyzováno 17 pacientů
 sledování do CR+6, nebo 24 měsíců od diagnózy
 Analýza qPCR dle ESG-MRD-ALL GUIDELINES
Průběžné výsledky
Shrnutí - cfDNA
 Metoda mnohá technická úskalí ale funguje
 Zatím není zanalyzováno dostatečné množství pacientů
 Pokračujeme v analýzách
Nové markery pro MM
 MikroRNA
 Cell-free DNA
 LncRNA
Dlouhé nekódující molekuly RNA
 > 200 nt
 Intergenové, intronové, …
 Většinou v jádře
 Transkripce RNA polymerázou II (III)
 Post-transkripční modifikace
 Nepřítomnost otevřených čtecích rámců (ORF)
 Tkáňově specifická exprese
 Regulace genové exprese
Mercer, 2009
Derrien, 2012
Molekulární podstata funkce lncRNA
 Aktivace transkripce genů
 Represe transkripce genů
 Modifikace funkce chromatinu a histonů
Mercer, 2009
Derrien, 2012
LncRNA v nádorech
 Účast v mnoha procesech včetně tumorigeneze
 Změny exprese u různých nádorů
 Některé specifické pro daný typ nádoru – PCA3 u
karcinomu prostaty
 Onkogeny – HOTAIR vysoká exprese v nádorech prsu
 Vznik metastáz a prognóza – HOTAIR
 Supresory – MEG3 – stimuluje transaktivaci p53
Mercer, 2009
Derrien, 2012
LncRNA v buňkách MM
Explorativní fáze
• 6 MM vs. 6 HD CD138+
* fenotyp zdravých PC buněk: CD45+/dim, CD38+, CD19+, CD56-
27 lncRNA p < 0,01
• 14 nižší exprese
• 13 vyšší exprese u MM
 40 MM vs. 19 ZD
 rozdílná exprese UCA1 mezi MM a ZD:
UCA1 (p<0,0001)
Validační fáze
U C A 1 e x p re s s io n
LOG2
-dCT
normalizedexpression
M
M
H
D
-8
-6
-4
-2
0
 marker pro nádory močového měchýře, karc.žaludku
 popsána u AML
 Korelace s biochemickými parametry a cytogenetikou
 Prognostický význam pro celkové přežití
LncRNA UCA1
 time-dependent ROC, rozdělení na skupiny s vyšší a nižší
expresí UCA1
Analýza přežití
Sedlarikova et al 2017
 deregulována u MM s vysokou senzitivitou i specificitou
 korelace s biochemickými parametry, cytogenetikou, ISS
 potenciální biomarker prognózy MM
LncRNA UCA1
Cirkulující LncRNA
Cirkulující lncRNA u MM
 TUG1, MALAT1, HOTAIR, GAS5 deregulovány v
plazmě PK u MM pacientů
 Jen TUG1 deregulována s porovnání s ZD
Isin 2014
Cirkulující lncRNA u MM |Brno
 Porovnání lncRNA z exozomální/neexozomální frakce
séra u MM, MGUS a ZD na platformě Qiagen
Validace lncRNA na MM, MGUS a ZD
 PRINS, LINC-ROR, UCA1, NEAT1
 50 MM, 50 MGUS, 30 ZD
 qPCR
Exozomální a neexozomální frakce
PRINS
p < 0,0001
log2-deltact
normalizovanáexprese
ZD
EXO
M
M
EXO
M
G
U
S
EXO
-5
-4
-3
-2
-1
0
*
*
PRINS
p = 0,0243
log2-deltact
normalizovanáexprese
ZD
Serum
M
M
Serum
M
G
U
S
Serum
-5
-4
-3
-2
-1
0 *
Hladiny exprese lncRNA PRINS v exosomální (p<0,0001)
a neexosomální (p=0,0243) frakci séra PK u MM, MGUS a
ZD
LncRNA
 PRINS odlišuje MG pacienty od ZD
 Ale nízká sensitivita i specificita
 Korelace s cytogenetikou
 Nutná lepší platforma nebo NGS
Shrnutí
 MM onemocnění starších lidí
 Nové léky zlepšují přežívání
 Potřebujeme nové snadno dostupné markery pro MM,
nejlépe z PK
 Několik možností – miRNA, cf-DNA, lncRNA
 splňují kritéria dobrých biomarkerů
 Doufáme, že se podaří zlepšit diagnostiku a
monitorování MM pacientů
Výhledy do budoucna –
tekuté biopsie?
 Biopsie z periferní krve –
schopné zahrnout celou
heterogenitu nádoru
 Méně bolestivé
 I jiné molekuly
 Velký potenciál
Poděkování
Babákova myelomová
skupina,
Ústav patologické fyziologie,
Lékařská fakulta, MU
Sabina Ševčíková
Veronika Kubaczková
Lenka Sedlaříková
Božena Bollová
Martina Valachová
Jana Gregorová
Veronika Kelbichová
Kamila Novosadová
Oddělení klinické
hematologie,
Fakultní nemocnice Brno
Miroslav Penka
Martina Almáši
Renata Bezděková
Božena Hanáková
Lucie Říhová
Barbora Sáblíková
Renata Suská
Pavla Všianská
Interní hematologická a
onkologická klinika
Fakultní nemocnice Brno
Zdeněk Adam
Marta Krejčí
Luděk Pour
Viera Sandecká
Martin Štork
Institut biostatistiky a
analýz
LF MU
Jiří Jarkovský
Lucie Brožová
Oddělení klinické hematologie
Fakultní nemocnice Ostrava
Roman Hájek
Tomáš Jelínek
Fedor Kryukov
Elena Kryukova
Zuzana Kufová
Laboratoř molekulární
cytogenetiky
Ústav experimentální
biologie, PřF MU
Petr Kuglík
Aneta Mikulášová
Jan Smetana
Markéta Wayhelová
Ústav patologické fyziologie
Lékařská fakulta, MU
Anna Vašků
Děkuji za pozornost