Téma P09: Diagnostika spirochetálních infekcí K nastudování: Borrelia, Leptospira,Treponema (z učebnic, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, PCR, průkazy antigenů a protilátek Lymeská borrelióza Společná tabulka pro úkoly 1, 2 a 3. Abs. = hodnota absorbance Písmeno pacienta Krátký klinický popis (1–3 slova charakterizující situaci) ELISA (Úkol 1) W. blotting (Ú2) PCR (Ú3) (+/–) Závěr: konečná interpretace, dopor. případné léčby IgM IgG IgM (+/–) IgG (+/–) Abs. (+/–) Abs. (+/–) J K L M N Úkol 1: Průkaz protilátek proti Borrelia garinii metodou ELISA Odečtěte podle výkladu vyučujícího výsledek reakce u pacientů s podezřením na lymeskou borreliózu. Určujeme protilátky ve třídě IgG a IgM. V poli A1 (odpovídá důlku A1 v mikrotitrační destičce) naleznete hodnotu CAL (= v postatě cut-off; všechny hodnoty absorbance nad CAL jsou pozitivní, vše pod CAL budiž negativní). V polích B1 a C1 jsou kontroly. Pacienti označení písmeny J až N jsou v barevně označených polích. Zapište hodnotu CAL, zkontrolujte, jestli negativní a pozitivní kontrola je v pořádku. Pak odečtěte a vyhodnoťte výsledky ELISA reakce pro pacienty No. J, K, L, M, N (ty nepište sem, použijte hlavní tabulku nahoře). Hodnota CAL (důlek A1): Hodnota absorbance K+ (důlek B1): r K+ je OK r K+ není OK ß zaškrtněte, co platí IgM Hodnota absorbance K– (důlek C1): r K– je OK r K– není OK Hodnota CAL (důlek A1): Hodnota absorbance K+ (důlek B1): r K+ je OK r K+ není OK ß zaškrtněte, co platí IgG Hodnota absorbance K– (důlek C1): r K– je OK r K– není OK Úkol 2: Průkaz protilátek proti Borrelia garinii pomocí Western blottu U pacientů řešených v úkolu č. 1 se vzorky séra či likvoru testovaly také Western blottem. Odečtěte výsledky dle instrukcí. Pro odečtení reakce použijte kontrolní proužek. Diagnostické schéma je vždy stejné: ELISA je použita ke screeningu, Western blot ke konfirmaci jejích výsledků. Odečtěte Western blot u pacientů J až N a zapište výsledky do hlavní tabulky. Úkol 3: Diagnostika Lymeské borreliózy pomocí PCR Pomocí dané fotografie PCR produktu na agarózovém gelu zakreslete a zaznamenejte, který z testovaných vzorků je pozitivní. PCR diagnostika se prováděla s ohledem na závažnost anamnézy pouze u dvou z pěti řešených pacientů. Poté proveďte celkové zhodnocení všech tří úkolů a zapište závěr. Syfilis Úkol 4: Přímý průkaz syfilis. Přímý průkaz syfilis je možný pouze v případě zaslání vhodných vzorků do laboratoře. V některých stádiích nemoci však není k mání žádný vhodný vzorek pro tento účel. a) Rabbit infectivity test – RIT Zapište název králíka používaného pro tento test. (Je odvozen z tohoto souostroví: àààààààààà.) Exudát z podezřelého vředu je zpravidla vyhodnocován zástinovou mikroskopií a očkován do králičích varlat. Testované zvíře začíná trpět orchitidou 10 dní po naočkování. Název králíka: b) Mikroskopie v zástinu Podívejte se na mikrofotografii treponemat ze zástinové mikroskopie, zakreslete princip zástinové mikroskopie a zaznamenejte výsledek svého pozorování. c) Přímá imunofluorescence Podívejte se na mikrofotografii treponemat získanou z fluorescenčního mikroskopu a zaznamenejte výsledek. 4b) princip 4b) výsledek 4c) Původce syfilis, Treponema pallidum subsp. pallidum, NENÍ kultivovatelný organismus. Diagnostika závisí na stádiu nemoci. Nepřímý průkaz syfilis Společná tabulka pro úkoly 5 a 6. Písmeno pacienta Krátká klinická charakterizace případu Úkol 5 screening Úkol 6 konfirmace Závěr: konečná interpretace, doporučení případné léčby RRR TPHA FTA-ABS ELISA WB IgM IgG IgM (+/–) IgG (+/–) Absor- bance (+/–) Absor- bance (+/–) A B C D E Úkol 5: Screening syfilis – RRR a TPHA Těhotné ženy a dárci krve jsou screeningově vyšetřováni rychlou reaginovou reakcí (RRR) a Treponema pallidum pasivní hemaglutinací (TPHA). Posuďte výsledky screeningu u předložené skupiny osob a stanovte, u koho je třeba ještě zajistit podrobnější, tzv. konfirmační (potvrzovací) vyšetření. Výsledky zapište přímo do tabulky. RRR: pozitivní je vyvločkování. TPHA: pozitivní je tvorba aglutinátu. Více viz praktikum J07. Úkol 6: Konfirmace syfilis – FTA-ABS, ELISA a Western blotting Vyhodnoťte výsledky FTA-ABS, ELISA a western blottingu (WB) u pacientů se suspektní syfilis (viz předchozí úkol). Spočítejte cut-off a porovnejte s ním hodnoty pozitivní a negativní kontroly a výsledky pacientů. V poli/důlku A1 je přítomen blank. Hodnota cut off (C1 + D1) / 2 Hodnota absorbance K– (pole/důlek B1): r K– je OK r K– není OK ß zaškrtněte, co platí IgM Hodnota absorbance K+ (pole/důlek E1): r K+ je OK r K+ není OK Hodnota cut off (C1 + D1) / 2 Hodnota absorbance K– (pole/důlek B1): r K– je OK r K– není OK ß zaškrtněte, co platí IgG Hodnota absorbance K+ (pole/důlek E1): r K+ je OK r K+ není OK Leptospiróza Úkol 7: Přímý průkaz Leptospira sp. Podle daného obrázku popište a zakreslete morfologii leptospir kultivovaných na tekutém Korthoffově médiu po dva týdny. Pro test byla použita moč pacienta s podezřením na leptospirózu.