Jana Juránková OKM FN Brno Vyšetřovací metody v mikrobiologii —Přímý průkaz – průkaz přítomnosti bakterií nebo virů– bakteriologie, virologie — —Nepřímý průkaz – průkaz reakce makroorganizmu na přítomnost bakterií nebo virů - sérologie Vyšetřovací metody v bakteriologii —Mikroskopie —Kultivace —Průkaz antigenů —Průkaz metabolitů —Průkaz nukleových kyselin Mikroskopie —Preparát nativní —Preparát barvený —Barvení podle Grama —Barvení podle Giemsy —Barvení podle Ziehl – Nielsena —Barvení spor —Barvení pouzder —Fluorescenční barvení — — — Nativní preparát —Suspenze materiálu nebo kultury ve fyziologickém roztoku — —Pro pozorování živých mikroorganizmů, posouzení jejich pohyblivosti — —100 – 400násobné zvětšení — Nativní preparát - využití —Bakteriologie – sledování typického pohybu bakterií (listerie) —Parazitologie – průkaz střevních parazitů ve stolici —Mykologie – sledování růstu a množení kvasinek • • Nativní preparát nativní preparát kvasinky Barvení podle Grama —Hans Christian Joachim Gram, 1884 — —Dělí bakterie do dvou základních skupin — —Grampozitivní G +, modrofialové —Gramnegativní G -, růžovočervené — Barvení podle Grama —Barvitelnost podle složení buněčné stěny —Fixace plamenem nebo metanolem —Postup barvení: —Krystalová violeť – 20 s —Lugolův roztok – 20 s —Oplach vodou —Odbarvení acetonalkoholem – 10 s —Safranin – 1 min — — Barvení podle Grama —Mikroskopie při 1000násobném zvětšení — —Pozorování pomocí imerzního oleje mezi preparátem a objektivem Barvení podle Grama Grampozitivní Pneumokok_spu Barvení podle Grama Gramnegativní P1010132 Barvení podle Grama Význam —Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií — —Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie Barvení podle Giemsy —Původně podle Giemsy – Romanovského —Slouží k diferenciaci buněčných struktur —Použití hlavně v parazitologii: —Mikrobiální obraz poševní – průkaz Trichomonas vaginalis —Diagnostika malárie —Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů —Fixace metanolem Barvení podle Giemsy —Azur a eosin rozpuštěný ve směsi glycerinu a metanolu — —Ředěn neutrální destilovanou vodou — —Roztok není stabilní, používá se vždy čerstvý Barvení podle Giemsy — patientImages%255C8327 Barvení podle Ziehl - Nielsena —Barvení acidorezistentních tyčinek —Špatně barvitelné —Vysoký obsah lipidů v buněčné stěně — —Nejčastěji Mycobacterium sp. Barvení podle Ziehl - Nielsena —Fixace teplem —Barvení karbolfuchsinem —Zahřátí —Odbarvení kyselým alkoholem —Oplach —Dobarvení malachitovou zelení — Barvení podle Ziehl - Nielsena — M_BI_MB_02 Barvení pouzder —Pouzdra pevně lnou k buněčné stěně —Faktor virulence —Nepřijímají běžná barviva —Negativní barvení tuší —Na tmavém pozadí světlé dvorce pouzder —Význam pro posouzení virulence bakterií (pneumokoky) Negativní barvení — Negativecocci Fluorescenční barvení —Pomocí fluoreskujícího barviva —Imunofluorescence —Na hledaný antigen se naváže protilátka označená fluoreskujícím barvivem —Pozorování pomocí fluorescenčního mikroskopu Fluorescenční barvení — fapos Kultivační průkaz —Základní mikrobiologický postup —Cílem je získat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře —Identifikace mikroba —Určit citlivost k antimikrobním přípravkům — — Kultivační půdy — —Dělení podle konzistence — —Tekuté – k pomnožení bakterií —Polotuhé – ke sledování pohybu bakterií —Tuhé, pevné Kultivační půdy —Dělení podle funkce —Základní – masopeptonový bujon, krevní agar —Diagnostické – obsahují látky, které se mění vlivem metabolizmu bakterií (např. štěpení laktózy) —Selektivní – k výběrovému růstu bakterií, obsahují látky, které potlačují některé bakterie —Selektivně diagnostické Kultivační půdy —Dělení podle funkce (pokračování) — —Transportní - k transportu bez množení – umožňují přežití bakterií při transportu —Pomnožovací – tekuté, k pomnožení bakterií ve vzorku, mohou být i selektivní Podmínky kultivace —Dostatečná vlhkost prostředí —Optimální teplota: 37°C (4°C, 42°C) —Optimální pH půdy: 7,2 – 7,4 —Vhodná izotonie média: 0,5 – 1% NaCl —Dostatek vhodných živin —Vhodné plynné prostředí Dělení bakterií podle vztahu ke kyslíku —Striktně aerobní —Fakultativně anaerobní —Striktně ananerobní —Anaerobní aerotolerantní —Mikroaerofilní —Kapnofilní — Anaerostat P1010162 Nádoba pro anaerobní kultivaci P1010166 Termostat se zvýšenou tenzí CO2 P1010116 Kultivační půdy —Masopeptonový bujon —Krevní agar —Čokoládový krevní agar —Levinthalův agar —MacConkey agar —Sabouraudův agar —Desoxycholát – citrátový agar —Chromagary — Pomnožovací bujóny P1010159 Krevní agar – nárůst S.aureus S McConkey agar a krevní agar nárůst E.coli ESCO- izolace na KA+McC Karmali agar - nárůst Campylobacter sp. — C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\IMG_1117.JPG Identifikace bakterií —Podle morfologie —Podle růstových vlastností —Hmotnostní spektrometrie – metoda MALDI TOF —Podle biochemických vlastností —Selektivní půdy —Komerční diagnostické soupravy —Podle antigenní struktury —Latexová aglutinace — — Biochemické určení bakterií C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\IMG_1109.JPG Biochemické určení bakterií C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\IMG_1115.JPG C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\IMG_1116.JPG Biochemické určení bakterií P1010151 Stanovení citlivosti na antibiotika —Disková difúzní metoda —Difuze antibiotik z disků do půdy a zábrana růstu bakterií — —Diluční testy —Stanovení koncentrace antibiotika, která je ještě na mikroba účinná Disková difúzní metoda přelévaný test Diluční metoda – mikrotitrační destičky destička MIC 2 Diluční metoda – E-test C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010087.JPG Průkaz antigenů z materiálu —Latexová aglutinace — vyšetření likvoru, moče —Imunochromatografie — vyšetření moče – Legionella pneumophila, —S. pneumoniae — vyšetření stolice – Clostridium difficile, střevní viry, Helicobacter pylori Latexová aglutinace P1010143 Průkaz metabolitů —Těžko kultivovatelné bakterie — —Rychlý průkaz —Např.infekce Helicobacter pylori — průkaz produkce ureázy Průkaz nukleových kyselin —Průkaz přítomnosti mikroorganizmu v klinickém vzorku — —Druhové identifikace izolovaného mikrobiálního kmene