Serologické vyšetřovací metody Serologické reakce • Přímý průkaz • üprůkaz antigenu üprůkaz nukleové kyseliny • Nepřímý průkaz • üprůkaz protilátek • Nepřímý průkaz • = průkaz specifických protilátek neboli průkaz serologický • •serologické reakce – reakce mezi antigeny a protilátkami in vitro •Materiál: 5 - 7 ml srážlivé krve, likvor, synoviální tekutina Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Neutralizace 5.Reakce se značenými složkami: – - imunofluorescence – - enzymová imunoanalýza – - Western blot (imunoblot) • • • Precipitace •antigen koloidní povahy •precipitační neboli vločkovací testy na lues •VDRL, RRR, RPR • • kardiolipin + protilátky v séru precipitace P5280008 vdrl2 Aglutinace •antigen korpuskulární povahy •antigen + hledaná protilátka viditelný shluk (aglutinát) •přímá, nepřímá (na nosičích) •průkaz protilátek u salmonelózy (Widalova reakce), yersiniózy, listeriózy, tularémie P2080013 •Aglutinace – průkaz protilátek proti Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis Aglutinace na nosičích •antigen navázaný na vhodnou částici: ü latex – latexová aglutinace ü erytrocyt – pasivní hemaglutinace • •TPHA – T. pallidum hemagglutination – •erytrocyty potažené treponemovým Ag •protilátky v séru •hemaglutinace •+ • • • P5280004 • •TPHA – průkaz protilátek proti T.pallidum pasivní hemaglutinací Komplement fixační reakce • ükomplex antigen + hledaná protilátka ükomplement üindikátorový neboli hemolytický systém (beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou) ü ü • zábrana hemolýzy hemolýza • pozitivní reakce negativní reakce cf_test2 •Komplement fixační reakce •pozitivní •negativní Neutralizační reakce •protilátka brání biologickým účinkům antigenu •ASLO – průkaz antistreptolyzinu O • • přítomnost ASLO ve vyšetřovaném séru • • zábrana hemolýzy • pozitivní reakce P2090016 •Neutralizační reakce - průkaz ASLO Imunofluorescence •jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu •přímá – průkaz antigenu: T.pallidum •nepřímá – průkaz protilátek: syfilis, anaplazmóza, HHV6 • trepon01 •Nepřímá imunofluorescence •- protilátky proti T.pallidum Enzymová imunoanalýza •jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný substrát za vzniku barevného produktu •Výsledek: barevná reakce •Hodnocení: měření absorbance •ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) •průkaz antigenu: HBsAg, respirační viry, chlamydie •průkaz protilátek: univerzální použití Princip metody ELISA elisa3 Obrázek2 P2080015 •ELISA – průkaz HBsAg •Souprava pro vyšetření metodou ELISA Western blot • Antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém pásku 1.vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce 2.přidání protilátky značené enzymem 3.přidání substrátu 4.výsledná reakce – barevný proužek Obrázek2 P5280005 • • • •Western blot T.pallidum IgG •Autoblot 2000, Medtec, USA Snímek 004 •Autoblot 6000, Medtec, USA WB02 •Western blot B.garinii IgG Interpretace serologických výsledků •průkaz protilátek svědčí pro setkání s antigenem (kdy ?), k diagnóze infekce většinou nestačí •vyjímka: syfilis, infekce HIV • •dynamika imunitní reakce: • • setkání s antigenem průkaz protilátek •10 dní •IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik měsíců, svědčí pro čerstvou infekci •IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo nedávnou infekci •IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění, mohou přetrvávat roky Výsledek obrázku pro dynamika jednotlivých tříd protilátek Serologický průkaz infekce •vyšetření dvou vzorků séra: akutní na začátku onemocnění, rekonvalescentní za 10 až 14 dní •průkazný nález: čtyřnásobný vzestup titru nebo serokonverze •vzorky nutno vyšetřit zaráz ! • • titr protilátek = nejvyšší ředění, v němž ještě došlo k prokazatelné serologické reakci PCR •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK bakterií, virů, kvasinek, parazitů •různé modifikace •výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace •PCR – příklady termocyclerů C:\Users\27958\Desktop\big-rotorgene.jpg C:\Users\27958\Desktop\smart-cycler-system.jpg Princip PCR •opakované cykly tří jednoduchých reakcí: –denaturace dvojšroubovice hledané DNA na dvě izolovaná vlákna (94 °C) –annealing - připojení dvou krátkých syntetických nukleotidů (primery) na tato vlákna (54 – 65 °C) –prodlužování primerů v přítomnosti vhodných reakčních složek a enzymu Taq-polymerasy za vzniku dvou kopií hledané DNA (72 °C) pcranimatie