13. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018 1 VLASTNOSTI PROTEINŮ Roztoky proteinů ve vodě mají vlastnosti molekulárních koloidních disperzí. Rozpustnost proteinů je dána přítomností aminokyselin, které obsahují v postranním řetězci polární skupinu. Rozpustnost proteinů závisí na jejich náboji a na stabilitě jejich hydratačního obalu. S rostoucí velikostí výsledného náboje (rozdílu mezi počtem kladných a záporných nábojů) proteinu se zvyšuje jeho rozpustnost. Poněvadž proteiny obsahují kyselé a bazické aminokyseliny, které obsahují v postranním řetězci ionizovatelné skupiny, lze velikost výsledného náboje proteinu ovlivnit změnou pH roztoku. V tzv. izoelektrickém bodě (pI) je počet jeho kladných a záporných nábojů shodný a částice se chová navenek jako elektroneutrální. V izoelektrickém bodě se protein nepohybuje v elektrickém poli, roztok má nejmenší elektrickou vodivost, osmotický tlak, viskozitu a nejsnáze se protein sráží dehydratačními činidly (ztráta hydratačního obalu). Rozpustnost proteinů velmi výrazně ovlivňuje přítomnost iontů v roztoku. Ve vodě lze jejich rozpustnost zvýšit přídavkem malého množství soli (vsolování), jejíž ionty se podílí na stabilizaci hydratačního obalu proteinu, snížení interakcí mezi nabitými skupinami proteinů a zvýšení interakcí proteinu s molekulami rozpouštědla. Se zvyšující se hodnotou iontové síly roztoku se rozpustnost proteinu po dosažení určité maximální rozpustnosti postupně snižuje, až dojde k úplnému vysrážení daného proteinu z roztoku (vysolování). Příčinou tohoto vysolení je snížení aktivity molekul vody (ionty soli soutěží s proteiny o molekuly rozpouštědla), čímž se mimo jiné snižuje elektrostatické odpuzování shodně nabitých skupin proteinů. Různé soli se ve vysolovacím účinku velmi liší. Nejsilnější vysolovací účinek mají fosfáty a sírany, nejmenší jodidy a chloristany. Kationty v porovnání s anionty mají na rozpustnost proteinů mnohem menší vliv. Koncentrace soli, při které dochází k vysolování proteinů, je dána jednak typem proteinu, ale rovněž typem soli a hodnotou pH (nejnižší rozpustnost je v izoelektrickém bodě). Odstraněním přídavku soli (např. zředěním, dialýzou) se proteiny opět rozpustí a obnoví se jejich nativní funkce (renaturace). Vysolování se používá v prvních krocích při izolaci proteinů ze směsí za účelem zakoncentrování nebo částečného oddělení od ostatních látek z roztoku (tzv. frakcionace). Pro vysolování proteinů se nejčastěji používá síran amonný (je velmi dobře rozpustný a vykazuje malý denaturační účinek na proteiny). Při jeho použití se však musí sledovat hodnota pH roztoku, poněvadž v důsledku hydrolýzy dochází k okyselování roztoku. Do roztoku s proteiny se přidává buď pevný (rozetřený v třecí misce) v malých dávkách nebo ve formě nasyceného roztoku. Během přídavků soli je nutno s roztokem neustále míchat, aby se zabránilo lokálnímu nasycení. Většina proteinů se sráží z roztoku mezi 30–75 % nasycení, tzn. po přídavku takového množství soli do roztoku, které odpovídá 30–75 % množství soli potřebného ke vzniku nasyceného roztoku této soli. Po přidání potřebného množství soli se roztok proteinů míchá asi 30 minut, aby se ustálila rovnováha, a sraženina se poté oddělí od roztoku centrifugací. Iontová síla Log(rozpustnost) 13. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018 2 Aktivitu molekul vody (stabilizaci hydratačního obalu proteinů) a tím i rozpustnost proteinů lze snížit přídavkem organických rozpouštědel, např. ethanolu nebo acetonu, které v důsledku snížení dielektrické konstanty prostředí zvyšují elektrostatické interakce mezi opačně nabitými skupinami proteinu. V porovnání se solemi vykazují však větší denaturační účinek, proto se provádí srážení za nízké teploty (pod 0 ºC) a udržování pH na požadované hodnotě. Po snížení koncentrace organického rozpouštědla se získá zpět nativní protein. Za vyšší teploty dochází ve větší míře k ireverzibilní denaturaci. Nativní konformace proteinů jsou v roztoku poměrné málo odolné vůči různým fyzikálním a chemickým vlivům, které rozrušují částečně nebo i úplně nevazebné interakce, které stabilizují terciární a sekundární strukturu. Pokud se poruší kovalentní struktura proteinu (tzn. peptidové vazby v primární struktuře), protein ztratí své biologické vlastnosti. Tento děj nazýváme denaturace. Při denaturaci proteinu přechází jeho vysoce uspořádaná nativní konformace do stavu částečně nebo zcela neuspořádaného (tzv. náhodného klubka). Z fyzikálních činitelů způsobuje denaturaci např. teplo (u většiny proteinů již teplota nad 40−50 ºC), třepání, vysoký tlak, UV záření, ultrazvuk. Z chemických vlivů jsou to např. silné kyseliny a hydroxidy, kationty těžkých kovů, tenzidy, některé organické kyseliny. Citlivost různých proteinů vůči uvedeným vlivům není stejná a závisí rozdílnou měrou na hodnotě pH roztoku, jeho iontové síle, druhu přítomných iontů atd. Denaturace je často nevratná (ireverzibilní), u některých proteinů za vhodných podmínek může být vratná (renaturace). Denaturací proteinu se zpravidla značně snižuje jeho rozpustnost. Denaturovaný protein se sráží spontánně z koncentrovaných roztoků, jinak jen při porušení podmínek stability koloidní disperze (tj. porušení hydratačního obalu a/nebo „vynulování“ výsledného náboje proteinů). Ireverzibilní denaturace se používá např. při detekci proteinů v moči nebo při odstraňování proteinů (tzv. deproteinaci) z krevního séra či plazmy před stanovením některých metabolitů. 13. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018 3 PRAKTICKÁ ČÁST Úkol 13.1 Stanovení izoelektrického bodu kaseinu Kasein je hlavním proteinem kravského mléka (50–80 % celkového obsahu proteinů). Izoelektrický bod kaseinu lze přibližně stanovit tak, že se mléko postupně smíchá s pufry o různé hodnotě pH a vyhledá se takový, v němž se protein nejsnáze sráží. Materiál: Citrát-fosfátové pufry pH 2,5–6,0 (řada osmi roztoků s diferencí pH 0,5, připravených z citronové kyseliny 0,05 mol/l a Na2HPO4 0,1 mol/l), mléko zředěné vodou v poměru 1:1. Plastové pipetky, zkumavky, popisovač. Provedení:  Do 8 zkumavek odměřte cca 2 ml pufru. Každá zkumavka bude obsahovat pufr s jinou hodnotou pH v rozmezí 2,5–6,0.  Poté do každé zkumavky přidejte po cca 1 ml zředěného mléka a dobře promíchejte.  Po několika minutách hodnoťte stupeň vysrážení (přítomnost sraženiny, její objem, vzhled supernatantu) v jednotlivých zkumavkách.  Dle stupně vysrážení odhadněte hodnotu izoelektrického bodu kaseinu.  1. Odhadněte hodnotu izoelektrického bodu kaseinu.  2. Vzhledem ke zjištěné hodnotě izoelektrického bodu určete, jaký náboj bude převládat na molekule kaseinu v prostředí o pH 5,5? Úkol 13.2 Rozpustnost proteinů, srážení proteinů z roztoků Mezi významné faktory, které ovlivňují rozpustnost proteinů v roztoku, patří přítomnost solí, organických rozpouštědel, pH a teplota. Materiál: Roztok proteinů (10 g/l), jemně rozetřený chlorid sodný kryst., ethanol denaturovaný methanolem, roztok trichloroctové kyseliny (1 mol/l), konc. HNO3, zředěná CH3COOH (2 mol/l). Lopatička. Plastové pipetky, zkumavky, popisovač. a) Vysolování proteinů  K přibližně 1 ml roztoku proteinů přidávejte postupně po malých částech jemně rozetřený chlorid sodný. Po každém přídavku soli obsah zkumavky promíchejte. Pokračujte v přídavcích soli tak dlouho, dokud se bude sůl rozpouštět.  Poté obsah zkumavky zřeďte dvojnásobným objemem vody. Pozorujte, zda dojde ke změně rozpustnosti vysrážených proteinů. 13. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018 4 b) Srážení proteinů ethanolem  K asi 0,5 ml roztoku proteinů přidávejte po částech 4–6násobné množství ethanolu, po každém přídavku ethanolu, roztok dobře promíchejte.  Poté obsah zkumavky zřeďte stejným objemem demi-vody a pozorujte změny ve zkumavce.  3. Vysvětlete vliv soli a ethanolu na chování proteinů v roztoku.  4. Uveďte, za jakých podmínek je srážení reverzibilní. c) Srážení proteinů po jejich tepelné denaturaci  Roztok proteinů (cca 1 ml) ve zkumavce umístěte do vroucí lázně na 2 min.  Po ochlazení obsahu zkumavky, přidejte několik kapek zředěné octové kyseliny.  Vyhodnoťte změnu rozpustnosti proteinů bezprostředně po tepelné denaturaci a poté po okyselení roztoku.  5. Jak vysvětlíte změnu rozpustnosti denaturovaných proteinů v mírně kyselém prostředí (při pH 5)? d) Srážení proteinů koncentrovanou kyselinou dusičnou  Do zkumavky odměřte přibližně 1 ml koncentrované kyseliny dusičné.  Poté, po nakloněné stěně zkumavky opatrně navrstvěte nad roztok kyseliny roztok proteinů, obsah zkumavky nepromíchávejte.  Pozorujte bílý prstenec vysrážených proteinů, který se vytvoří na rozhraní roztoků.  6. Popište, k jakým změnám došlo ve zkumavce. Reakce se pod názvem Hellerova zkouška používala k důkazu proteinů v moči. e) Srážení proteinů kyselými deproteinačními činidly  K přibližně 1 ml roztoku proteinů ve zkumavce přidejte několik kapek roztoku trichloroctové kyseliny, obsah zkumavky promíchejte.  Pozorujte vysrážení proteinů z roztoku, které je kompletní po několika minutách.  Obsah zkumavky zřeďte dvojnásobným objemem demi-vody a pozorujte chování sraženiny.  7. Popište výsledek. 13. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018 5 Úkol 13.3 Stanovení koncentrace celkových proteinů Stanovení množství celkových proteinů v roztoku je založeno na zjištění: a) množství dusíku, který se obvykle stanoví Kjeldahlovou metodou. Množství proteinů lze pak zjistit např. výpočtem ze vztahu koncentrace proteinů = 6,25 ∙ Nprot (většina proteinů obsahuje průměrně 16 hmotn. % dusíku, tj. 1/0,16 = 6,25), Nprot je množství bílkovinného dusíku. b) množství peptidových vazeb (biuretová reakce, metoda Bradfordové, částečně metody viz odst. c) Stanovení proteinů metodou Bradfordové V prostředí kyseliny fosforečné barvivo Coomassie briliant blue G-250 se váže s peptidovou vazbou za vzniku komplexu, který vyvolá posun absorpčního maxima z 465 nm na 595 nm. c) množství některé aminokyseliny (Lowryho metoda, pomocí bicinchoniniové kyseliny) Stanovení proteinů Lowryho metodou Folinovo-Ciocalteuovo činidlo (fenolové činidlo) poskytuje v alkalickém prostředí i s velmi slabě redukujícími látkami modré zbarvení, vzniklé redukcí fosfowolframanů a fosfomolybdenanů. Proteiny reagují především v důsledku přítomnosti fenolických řetězců tyrosinu. Barevná reakce je mnohem intenzivnější, provádí-li se po přídavku Cu2+ iontů, tzn. po biuretové reakci. Měďnaté ionty v komplexu s peptidovými vazbami jsou redukovány na ionty Cu+ zbytky Tyr, Trp nebo Ser. Vzniklé Cu+ ionty a radikály postranních řetězců výše zmíněných aminokyselin redukují FolinovoCiocalteuovo činidlo na modrý produkt. Stanovení proteinů pomocí bicinchoniniové kyseliny Princip je obdobný jako u Lowryho metody. Za alkalických podmínek ionty Cu2+ vytváří s peptidovou vazbou komplex, v kterém dochází k redukci Cu2+ na Cu+ za přítomnosti zbytků cysteinu, cystinu, tryptofanu a tyrosinu. Bicinchoniniová kyselina tvoří s Cu+ ionty v alkalickém prostředí modrofialový komplex. d) absorbance roztoku v UV oblasti spektra Stanovení koncentrace bílkovin pomocí měření absorbance v UV oblasti spektra je v porovnání s ostatními metodami velmi rychlé, poněvadž nevyžaduje žádné činidla ani inkubace. Při této metodě nedochází k znehodnocení vzorku. Nevýhodou této metody je, že jakákoliv látka absorbující v UV oblasti spektra interferuje s proteiny. Proteiny absorbují UV záření s absorpčním maximem při 280 nm (především Tyr, Trp) a 200 nm (peptidová vazba). Pro hrubý odhad stačí změřit absorbanci pouze při 280 nm: ρprot (mg/ml) = A280/b kde b je tloušťka vrstvy roztoku, jímž prochází záření. Eliminace nukleových kyselin. Pokud se v roztoku vyskytují nukleové kyseliny je nutno měření absorbance opakovat při vlnové délce 260 nm (absorpční maximum nukleových kyselin). Koncentrace proteinů se vypočítá např. ze vztahu: ρprot (mg/ml) = 1,55 A280 − 0,76 A260 13. cvičení Biochemický ústav LF MU 2018 6 Stanovení proteinů biuretovou reakcí Látky obsahující nejméně dvě peptidové vazby reagují s ionty Cu2+ v alkalickém prostředí za vzniku červenofialového komplexu. Metoda se používá na stanovení celkových proteinů v krevním séru nebo moči. Materiál: Biuretové činidlo (100 ml roztoku CuSO4 15 mmol/l a EDTA.Na2 0,18 mmol/l, se zředí vodou na 600 ml, za vydatného míchání se postupně přidá 200 ml roztoku NaOH 5 mol/l a doplní vodou na 1 litr). Kalibrátor-proteiny (koncentrace proteinů uvedena na štítku), vzorky. Mikropipetory 20 l a 5 ml. Spektrofotometr. Provedení  Do čistých, označených zkumavek odměřujte podle schématu: Roztok (µl) Slepý pokus Vzorek Standard Biuretové činidlo 1 000 1 000 1 000 Demi-voda 200 - Vzorek - 200 Kalibrátor-proteiny - - 200 Promíchejte a inkubujte 10 minut při pokojové teplotě. Změřte absorbance vzorků Ax a standardu ASTD při 545 nm proti slepému pokusu během hodiny. Výpočet hmotnostní koncentrace proteinů: STD STD x x   A A kde STD je hmotnostní koncentrace proteinů v kalibračním roztoku (uvedena na štítku)