• Praktikum 2 • •Imunoglobuliny – struktura a funkce; protilátky •Imunizace a získávání antisér •Monoklonální protilátky • •Tomáš Freiberger •Ústav klinické imunologie a alergologie •FN u sv. Anny v Brně • • •NOBELOVY CENY ZA IMUNOLOGII •1901 - E.A. Von Behring (Germany) for the work on serum therapy especially its application against diphtheria. •1905 - R. Koch (Germany) for the investigations concerning tuberculosis. •1908 - E. Metchnikoff (Russia) and P. Ehrlich (Germany) for their work on immunity (respectively, phagocytosis/cellular theory and humoral theory). •1913 - C.R. Richet (France) for the work on anaphylaxis. •1919 - J. Bordet (Belgium) for the discoveries relating to immunity (complement). •1930 - K. Landsteiner (Austria/USA) for the discovery of human blood groups. •1951 - M. Theiler (South Africa) for the discoveries and developments concerning yellow fever. •1957 - D. Bovet (Italy/Switzerland) for the discoveries related to histamine and compounds, which inhibit action of histamine and other substances on the vascular system and the skeleton muscles. •1960 - Sir F.McFarlane Burnet (Australia) and Sir P.B. Medawar (Great Britain) for the discovery of acquired immunological tolerance. •1972 - G.M. Edelman (USA) and R.R. Porter (Great Britain) for their discovery concerning the chemical structure of antibodies. •1977 - R. Yalow (USA) for the development of radioimmunoassays of peptide hormones. •1980 - B. Benacerraf (USA), J. Dausset (France) and G.D. Snell (USA) for their discoveries concerning genetically determined structures on the cell surface (major histocompatibility complex) that regulate immunological reactions. •1982 - S. K. Bergstrom (Sweden), B. I. Samuelsson (Sweden) and J. R. Vane (UK) for their discoveries concerning prostaglandins and related biologically active substances. •1984 - N.K. Jerne (Denmark/Switzerland) for theories concerning the specificity in development (lymphocyte clonality) and control of the immune system; + G.J.F. Köhler (Germany/Switzerland) and C. Milstein (Argentina/Great Britain) for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies. • •1987 - S. Tonegawa (Japan/USA) for the discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity. •1990 - J.E. Murray and E.D. Thomas (USA) for their discovery concerning organ and cell transplantation in the treatment of human diseases. •1996 - P.C. Doherty (Australia/USA) and R.M. Zinkernagel (Switzerland) for their discoveries concerning the specificity of the cell mediated immune defense ("dual recognition"). •1997 - S.B. Prusiner (USA) for the discovery of prions as a new biological principle of infection. •1999 - G. Blobel (USA) for discoveries concerning signal transduction. •2011 – J. Hoffmann, B. Beutler – mechanisms of innate immunity; R. Steinman – discovery of dendritic cells •Imunoglobuliny • • • IMUNOGLOBULINY •Struktura •Třídy, podtřídy •Vazba s antigenem, afinita, avidita •Antiidiotypová síť •Tvorba imunoglobulinů, protilátková odpověď •Biologické funkce protilátek •Polyklonální a monoklonální protilátky •IMUNOGLOBULIN = PROTILÁTKA • •strukturálně příbuzné glykoproteiny produkované B lymfocyty •vázané na membránu B lymfocytu – receptory zprostředkující aktivaci B lymfocytu •sekretované (rozpustné) – mediátory specifické humorální imunity Struktura molekuly protilátky •2 identické těžké řetězce (H) a 2 identické lehké řetězce (L) spojené disulfidickými můstky •strukturně podobné domény (110-120 AK): 2 u lehkých řetězců, 4-5 domén u těžkých řetězců •lehký i těžký řetězec –variabilní oblast (VH a VL); N-konec •každá oblast obsahuje 3 hypervariabilní úseky (6-10 AK) •vazba antigenu –konstantní oblast (CL, CH1-CH3/CH4); C-konec •CL - izotyp kappa, lambda •CH - izotyp (třída) protilátky (IgG, M, A, E, D), podtřídy • - membránově vázaná nebo sekretovaná forma • - biologické (efektorové) funkce protilátky •flexibilita vazebné části – pantová oblast mezi CH1 a CH2 D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-005-f003.jpg •Struktura molekuly protilátky vazba antigenu efektorová část amino- konec karboxy- konec proteolýza papainem: 2x Fab (antigen binding) + 1x Fc (constant) fragment Ig1.jpg •Schematické zobrazení sekretované a povrchově vázané molekuly protilátky transmembránová část CH Třídy a podtřídy imunoglobulinů Izotyp Podtřídy Koncentrace v séru Biol. poločas Funkce IgM - 0,9-2,5 g/l 6 d Receptor pro antigen (naivní B lymfocyty); primární odpověď; aktivace komplementu IgD - Stopa 3 d Receptor pro antigen (naivní B lymfocyty) IgG IgG1-4 8-18 g/l (převaha IgG1) 21 d Sekundární odpověď; neonatální imunita; aktivace komplementu; opsonizace; neutralizace IgA IgA1,2 0,9-3,5 g/l 6 d Slizniční imunita; opsonizace IgE - 0,0003 g/l 2 d Obrana proti parazitům; reakce časné přecitlivělosti •Třídy imunoglobulinů, formy výskytu IgA dimer (monomer, trimer) IgM pentamer (hexamer) IgG, IgE, IgD monomery Oligomery jsou spojeny J řetězcem. Membránové formy vždy jako monomer. IgM •vázaný na membránu ve formě monomeru – receptor na B lymfocytech – po navázání antigenu zprostředkuje aktivaci B lymfocytů, důležitý pro vývoj B lymfocytů •rozpustný ve formě pentameru (hexameru) – 10 (12) vazebných míst • •zajišťuje primární imunitní odpověď •účinná aktivace komplementu •IgM sekretovaná forma IgG1-4 •nejhojnější protilátka v séru, intersticiální tekutině •největší zastoupení má podtřída IgG1 •výskyt ve formě monomeru •nejdelší poločas (21 d) •přestup přes placentu • •klíčová úloha v sekundární imunitní odpovědi •aktivace komplementu, opsonizace, neutralizace • IgA1,2 •slizniční forma (dimer) – významná úloha ve slizniční imunitě (neutralizace, opsonizace; neaktivuje C) –produkován plazmatickými buňkami a B lymfocyty v submukóze –transportován na slizniční povrch pomocí transportního Fc receptoru (poly-Ig-receptor) –transport přes epitel transcytózou: endocytóza – přeprava v transportním váčku – fúze s luminální membránou – odštěpení z receptoru proteolýzou –část poly-Ig-receptoru zůstává po uvolnění na slizniční povrch součástí dimeru IgA = sekreční komponenta – zajišťuje rezistenci vůči proteázám •sérová forma (monomer, dimer, trimer) – opsonizace Vazba antigenu a protilátky •nekovalentní komplexy (iontové, hydrofobní, van der Waalsovy síly, vodíkové můstky) • vazba je reverzibilní • •vysoká diversita protilátek: > 1011 různých vazebných míst •komplementarita vazebného místa protilátky s epitopem antigenu –hypervariabilní oblasti VL a VH (CDR1-3 – complementarity determining regions) –jedinečnost vazebného místa dána procesem VDJ (VJ) rekombinace a somatickými hypermutacemi •přístupnost epitopů v závislosti na konformaci antigenu • Variabilní oblast Ig molekuly váže antigenní epitop vazebná část protilátky •Variabilní oblast imunoglobulinové molekuly D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-005-f005.jpg VDJ rekombinace při vzniku variabilního místa Germline configuration D to J recombination V to DJ recombination transcription, splicing V segments D segments J segments Constant region exons AAA Assembly Adapted from Janeway 2001 •Vliv konformace antigenu (přístupnosti epitopu) na vazbu s protilátkou D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-005-f012.jpg schema1.png Vysoká afinita Nízká afinita Ab1 Ag2 Ab1 Ag1 •Afinita protilátek -vyjadřuje sílu interakce mezi 1 epitopem daného antigenu a vazebným místem protilátky •Avidita protilátek D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-005-f013.jpg - vyjadřuje sílu interakce polyvalentní protilátky s polyvalentním antigenem (obsahuje více identických epitopů) Antiidiotypová síť •idiotop – specifická část molekuly imunoglobulinu zodpovědná za rozpoznání příslušného antigenu (část vazebného místa) •idiotyp – souhrn idiotopů – identické imunoglobulinové molekuly jsou charakterizovány určitým společným idiotypem •vazebné místo protilátky (idiotyp) vytvořené proti antigenu (protilátka 1. generace) je rozpoznáno jinou protilátkou (protilátka 2. generace, antiidiotypová protilátka) •idiotypová (antiidiotypová) síť následných generací protilátek může mít úlohu v regulaci imunitní odpovědi Interakce idiotyp-antiidiotyp antigen Antiidiotyp idiotyp Antibody Ab 1 Antibody Ab 2 Antibody Ab 3 Paratop Epitop Vývoj B lymfocytů, tvorba protilátek •pre-B lymfocyty: syntéza H řetězce IgM, VDJ rekombinace – pre-B receptor •nezralé B lymfocyty: syntéza H i L řetězců IgM, VDJ (VJ) rekombinace, B-cell receptor (BCR) •zralé B lymfocyty: exprese IgM a IgD na povrchu (BCR) • •vazba antigenu na BCR – aktivace a postupná diferenciace B lymfocytů do plazmatických buněk produkujících protilátky, vznik paměťových B lymfocytů –vyzrávání afinity – somatické hypermutace –izotypový přesmyk –převaha sekretované formy •Protilátková imunitní odpověď D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-011-f002.jpg •Změna struktury protilátek v průběhu imunitní odpovědi D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-005-f015.jpg Biologické funkce imunoglobulinových molekul •Aktivace komplementového systému (IgG, IgM) •Opsonizace (zejména IgG, též IgA) •Neutralizace antigenů (IgG, IgA, IgM) •Zábrana adherence (IgA, IgG) •Aglutinace, precipitace (IgG, IgM) •Degranulace žírných buněk (IgE) •Přechod placentou (IgG) •Imunoregulace (zejména IgG) • D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-012-f001.jpg •Biologické funkce imunoglobulinových molekul •Polyklonální a monoklonální protilátky •polyklonální (séra) –směs imunoglobulinových molekul s různou specificitou (zpravidla proti různým epitopům 1 antigenu) –příprava imunizací zvířat – •monoklonální –produkt 1 klonu B lymfocytů s jedinečnou specificitou –produkce nádorem z plazmatickým buněk (myelom) –příprava hybridomovou technologií D:\SCContent\9781437715286\graphics\fullsize\S9781437715286-005-f009.jpg Využití monoklonálních protilátek •v diagnostice ke klasifikaci lymfocytů a jiných leukocytů (CD markery, průtoková cytometrie) •v diagnostice infekčních či systémových onemocnění nebo nádorů, pokud jsou známy specifické antigeny (protilátky) vyskytující se u těchto onemocnění (bez ohledu na příčinnou souvislost; imunoanalýzy, průtoková cytometrie) •v terapii, k zacílení buněk a molekul důležitých v patogenezi nemocí •ve výzkumu Neuro-bottom Neuro-top NCPNEURO-logo •Typy monoklonálních protilátek používaných k terapii •Hohlfeld R et al. (2005) Drug Insight: using monoclonal antibodies to treat multiple sclerosis; Nat Clin Pract Neurol 1 34-44 [doi: 10.1038/ncpneuro0016] ncpneuro0016-F1 Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob •Imunosuprese: anti-CD3 (OKT3), –anti CD25 (basiliximab, daclizumab), –anti CD20 (rituximab) •Blokáda prozánětlivých cytokinů: –anti –TNF-a (infliximab, adalimumab) – revmatoidní artitida, Crohnova choroba, •Blokáda adhezivních molekul: –anti integrin a4b1 (natalizumab) – roztroušená mozkomíšní skleróza –Anti-CD11a (efalizumab) - psoriáza •Protialergická léčba: –anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu Příklady využití monoklonálních protilátek v léčbě zhoubných nádorů •Protilátky proti anigenům bílých krvinek: –anti CD-20 (rituximab) léčba lymfomů, –anti-CD52 (Alemtuzumab) – léčba lymfomů •Anti-receptorové protilátky: –anti-epidermal growth factor (receptor HER-2) (trastuzumab) – mamární karcinom –anti-epidermal growth factor (receptor EGFR) (cetuximab) – kolorektální karcinom • Další příklady využití monoklonálních protilátek v medicíně •Antiagregační léčba: –trombocytární receptor gpIIb/IIIa (abciximab) •Antivirová léčba: –RS virus (palivizumab)