Lymfocyty jako základní operační jednotky adaptivní imunity. Diferenciální krevní obraz. Subpopulace T a B lymfocytů. Imunofenotypizace buněk imunitního systému na průtokovém cytometru. Funkční vyšetření vyšetření lymfocytů (proliferace, tvorba cytokinů, ELISPOT). Praktikum č. 4 MUDr. Zita Chovancová, Ph.D. •lymfatické tkáně a orgány •buňky imunitního systému •molekuly imunitního systému ZÁKLADNÍ SLOŽKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU •Imunitní reakce je zajišťována různými druhy buněk a molekul a jejich vzájemnými interakcemi. • •Buňky imunitního systému spolu s buňkami pojivovými a dalšími strukturami tvoří funkční a anatomické celky … • • LYMFATICKÉ TKÁNĚ A ORGÁNY •primární lymfatické orgány •THYMUS •KOSTNÍ DŘEŇ • •sekundární lymfatické orgány •SLEZINA •LYMFATICKÉ UZLINY •ORGANIZOVANÉ SHLUKY LYMFATICKÉ TKÁNĚ –tonsily krční, nosní, jazyková, MALT, BALT, GALT s l e z i n a vyšetření sleziny U zdravých osob je slezina nehmatná. Hyposplenismus •vrozená asplenie •stavy po splenektomii •(význam vakcinace proti polysacharidovým antigenům – Str. pneumoniae, N. meningitidis) Splenomegalie: •hyperplasie buněk imunitního systému (infekce) •porušení průtoku krve (cirhóza jater, trombózy) •maligní procesy (primární i sekundární) •autoimunitní procesy (RA - Feltyho syndrom, SLE, hematologická onemocnění) •extramedulární hematopoéza l y m f a t i c k é u z l i n y vyšetření lymfatických uzlin Lymfadenopatie •blíže neurčené zvětšení lymfatických uzlin •Nejčastější příčiny zvětšení lymfatických uzlin: •imunitní reakce na antigen •infiltrace zánětlivými buňkami (lymfadenitida) •infiltrace a proliferace maligních buněk při imunologických (SLE, RA) a metabolických chorobách •U zdravých dospělých osob bývají axilární a inguinální uzliny hmatné (v průměru 1 cm). •V dětství je reakce lymfatických uzlin běžná. •U dospělých do 30 let je asi 80% lymfadenopatií benigních, u osob nad 50 let jen asi 40%. •Zvětšené uzliny mají diagnostický význam při infekci virem HIV. DIFERENCIÁLNÍ KREVNÍ OBRAZ odběr nesrážlivé krve do EDTA kojenci děti dospělí LEUKOCYTY 9 – 15 x 109/l 8 – 12 x 109/l 4 – 9 x 109/l GRANULOCYTY/POLYMORFONUKLEÁRY % % % neutrofilní granulocyty 25 - 65 35 - 70 55 - 70 • segmenty 22 - 65 25 - 65 50 - 70 • tyče 0 - 10 0 - 10 3 - 5 eozinofilní granulocyty 1 - 7 1 - 5 2 - 4 basofilní granulocyty 0 - 2 0 - 1 0 - 1 MONONUKLEÁRNÍ LEUKOCYTY % % % lymfocyty 20 - 70 25 - 50 25 – 40 monocyty 7 - 20 1 - 6 2 - 6 IZOLACE MONONUKLEÁRNÍCH BUNĚK z periferní krve Mononukleární buňky (PBMC) •leukocyty bez granulocytů (monocyty 20 %, lymfocyty 70 %) Postup izolace mononukleárních buněk: • 1. plná krev se naředí v buněčném kultivačním médiu 2. naředěná krev se opatrně vrství na denzní médium (Ficol) 3. CENTRIFUGACE 4. na původním rozhraní mezi naředěnou krví a denzním médiem se vytvoří tzv. lymfocytární prstenec (lymfocyty a monocyty) IMG_2111.JPG IMG_2090.JPG CD klasifikační systém (Paříž 1982) CD znaky (CD = cluster of differentiation) •molekuly buněčných membrán prokazované monoklonálními protilátkami (metodikou průtokové cytometrie) • •dnes známých více než 350 CD znaků (9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA9), březen 2010) •Využití v klinické praxi: vyšetření absolutního a relativního zastoupení buněčných subpopulací pomocí průtokové cytometrie (v imunologii rutinně vyšetření T-lymfocytárních, B-lymfocytárních subpopulací a NK buněk) •Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) • LYMFOCYTÁRNÍ SUBPOPULACE CD ZNAKY PROCENTUÁLNÍ ZASTOUPENÍ Z LYMFOCYTŮ T lymfocyty CD3+ 58 – 85 % Th lymfocyty CD3+CD4+ 30 – 60 % z CD3+ Tc lymfocyty CD3+CD8+ 15 – 35 % z CD3+ B lymfocyty CD19+ 7 – 23 % NK buňky CD16+/56+ 6 – 20 % ZÁKLADNÍ SUBPOPULACE B-LYMFOCYTŮ BCR receptor: IgM – Iga,Igb – CD19,CD21,CD81 B1 B lymfocyty •minoritní subpopulace B lymfocytů •nachází se v pleurální a peritoneální dutině, částečně ve střevě •tvoří tzv. „přirozené protilátky“ • B2 B lymfocyty •predominantní populace B lymfocytů •nachází se ve slezině a v lymfatických uzlinách tvořená v kostní dřeni v průběhu života •tvoří protilátky proti ostatním běžným antigenům ZÁKLADNÍ SUBPOPULACE T-LYMFOCYTŮ TCR receptor: CD3 komplex – ab (gd) – CD4/CD8 Th lymfocyty (CD3+CD4+) Th1 (IL-2, IFN-g) Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) Th17 (IL-17, IL-22) Treg (IL-10, TGF-b, IL-35) Tc lymfocyty (CD3+CD8+) NKT lymfocyty •po aktivaci tyto buňky produkují řadu cytokinů (vč. IFN-g a IL-4) R e g u l a č n í T l y m f o c y t y •regulační T lymfocyty mají regulační a imunosupresivní funkci •tyto „na vlastní antigeny reagující“ T-lymfocyty se vytváří v thymu • •jsou schopné aktivně suprimovat aktivaci další autoreaktivních T lymfocytů, které unikly negativní selekci v thymu • •představují 5 – 10 % CD4+ T lymfocytů konstituční (přirozené) Treg (Foxp3+CD4+CD25+) •neproliferují při polyklonální stimulaci •tlumí reakce T lymfocytů přímým kontaktem indukované Treg •tlumí buňky Th1, Th2, ale i jiné buňky prostřednictvím cytokinů Tr1 (TGF-β) jejich tvorba může být navozena nevyzrálými dendritickými buňkami prezentujícími antigen v nepřítomnosti vhodných kostimulačních ligandů Th3 (IL-4, IL-10 a TGF-β) navození orální tolerance na potravinové antigeny navození tolerance potřebných komenzálních patogenů GIT R e g u l a č n í T l y m f o c y t y PŘEHLED BUNĚČNÝCH IMUNOLOGICKÝCH VYŠETŘENÍ V rámci imunologického vyšetření buněčných subpopulací stanovujeme: •absolutní a relativní počty buněk imunitního systému •Vycházíme ze stanovení celkového počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu (absolutní a relativní počet lymfocytů, monocytů, granulocytů) •funkci buněk imunitního systému Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE •využívá principu přímé imunofluorescence •buňky jsou inkubovány s protilátkou proti konkrétním CD znakům na povrchu buněk imunitního systému, která je označena fluorescenčním barvivem • •buňky laminárně proudí tryskou přístroje vystaveny laserovému paprsku světla • Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE •na základě velikosti a granularity se buňky rozdělí na: oLYMFOCYTY, MONOCYTY a GRANULOCYTY •na základě navázání monoklonálních protilátek proti CD znakům na povrchu buněk se rozdělí na: osubpopulace T LYMFOCYTŮ, B LYMFOCYTŮ a NK BUŇKY Význam vyšetření pomocí průtokové cytometrie: •diagnostika primárních a sekundárních imunodeficiencí •diagnostika hematologických malignit Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace •Lymfocyty aktivovány •Polyklonálními mitogeny •pro B lymfocyty •pokeweed mitogen (PWM) •pro T lymfocyty •phytohemagglutinin (PHA) •konkanavalin A (ConA) •Specifickými antigeny •tuberkulin •tetanický toxoid • Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace •lymfocyty stimulovány k aktivaci specifickými nebo nespecifickými stimuly •po aktivaci se v kultuře dělí a proliferují •před koncem inkubace se do kultury přidá 3H thymidin, který se inkorporuje do nově syntetizované DNA •úroveň měřené radioaktivity, převedené scintilačním počítačem na světelný signál, odpovídá proliferační aktivitě lymfocytů (počet světelných impulzů/minutu) • Význam vyšetření proliferace lymfocytů: •diagnostika závažných imunodeficientních stavů Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro další specializovaná funkční vyšetření •Produkce a uvolňování důležitých cytokinů a tím i funkční vyšetření subpopulací T lymfocytů (Th1 a Th2) •ELISA, ELISPOT, PCR •Vyšetření exprese molekul významných pro buněčné synapse nebo aktivačních znaků na povrchu buněk •průtoková cytometrie •Schopnost tvorby imunoglobulinů B lymfocyty •ELISA, ELISPOT Funkční vyšetření T lymfocytů in vivo TUBERKULINOVÝ TEST test pozdního typu přecitlivělosti (IV. typ imunopatologické reakce) •aplikace antigenu intradermálně (tuberkulin) na dorzální stranu levého předloktí •časový odstup odečtu reakce 24 – 48 hodin • •vznik indurace a erytému v místě aplikace antigenu (hodnotí se pouze indurace) Funkční vyšetření T lymfocytů in vivo TUBERKULINOVÝ TEST test pozdního typu přecitlivělosti (IV. typ imunopatologické reakce) Pozitivní reakce indurace od 6 do 15 mm •normální odpověď u senzibilizovaného jedince indurace nad 15 mm (u dětí do 5 let nad 10 mm) •indikace k RTG vyšetření • Negativní reakce indurace do 6 mm •pacient nebyl dříve senzibilizován •porucha odpovídavosti T lymfocytů • Funkční vyšetření T lymfocytů in vivo TEST BUNĚČNĚ MEDIOVANÉ IMUNITY (CMI TEST, cell mediated immunity test) •intradermální aplikace tzv. anamnestických antigenů (tuberkulin, kandidin, toxoplasmin, tetanický toxoid, antigeny stafylokoků, streptokoků a další) • •pokud pacient neodpoví tvorbou indurace v místě aplikace antigenu do 48 hodin, je porušena pravděpodobně jeho T-lymfocytární odpovídavost (anergní pacient)