Téma P01: Diagnostika stafylokoků K nastudování: Rod Staphylococcus. (z internetu, učebnic apod.) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace. Poznámka: Všechny mikroskopické preparáty by měly být prohlíženy nejen na CX31, ale take na mikroskopu CX33 s kamerou a obrázek by měl být nasnímán, uložen do počítače a ukázán vyučujícímu jako důkaz, že jste úkol skutečně provedli. Na konci praktika musíte očistit mikroskop, vypnout ho a zakrýt, a rovněž odstranit uložené soubory z počítače (není-li řečeno jinak). Jakákoli manipulace s mikroskopy a počítači kromě toho, co je součástí úkolů nebo co provádíte na pokyn vyučujícího, je zakázána! Zejména je zakázáno jakékoli vkládání USB zařízení, což platí i pro učitelský počítač! Úkol 1:Mikroskopie infekčního materiálu V mikroskopu sledujte preparát z hemokultury obarvený podle Grama. Popište a zakreslete sledované útvary. Hemokultura je vzorek krve, smíchaný s transportně-kultivačním médiem a zaslaný do laboratoře. Celá zaslaná lahvička se kultivuje v automatickém kultivátoru a v případě pozitivity se mimo jiné provádí mikroskopie; více o hemokulturách a hemokultivaci se dozvíte v praktiku P13. Všímejte si přítomnosti bakterií (jejich tvaru, barvitelnosti a množství) dále také erytrocytů a dalších pozorovaných objektů. Nezapomeňte obrázek kreslit barevně a popsat vše, co vidíte. Pravidla z prvního jarního praktika stále platí! Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 2 až 7 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N Gramovo barvení – Úkol 2 Úkol 3: Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Hemo- lýza Jiné Úkol 4: růst na KA + 10 % NaCl Úkol 5: kataláza (pište „+“ či „–“) DÍLČÍ ZÁVĚR Úkol 6a: Test clump. faktor (+/–) Úkol 6b: Plasma-koaguláz. test (+/–) Úkol 6c: Test hyaluronidázy (+/–) Úkol 7: STAPHYtest 16 KONEČNÝ ZÁVĚR Pokud některý test u některého kmene neprovádíte, proškrtněte ho. Konečný závěr ale napište pro všechny. Úkol 2: Mikroskopie kultur mikroorganismů Kmen K Kmen L Kmen M Kmen N Obarvěte podle Grama čisté kultury předložených mikrobů. Výsledky pozorování zakreslete (↓) a zapište (↑). Úkol 3: Růst na krevním agaru Vyplňte tabulku na první straně v řádcích „Úkol č. 3“. Do „jiných“ napište to zajímavé, co se nevejde jinam. Úkol 4: Růst bakterií na krevním agaru s 10 % NaCl Zhodnoťte schopnost růstu předložených kmenů na krevním agaru s 10 % NaCl, který slouží jako selektivní půda pro stafylokoky. Zapište „+“ pokud kmen roste a „–“ pokud neroste. Úkol 5: Katalázový test Prokažte přítomnost enzymu katalasy. Setřete mikrobiologickou kličkou kolonie předložených kmenů a vneste je do kapky 3% H[2]O[2] na podložním sklíčku. Zaznamenejte reakci u všech kmenů. Do tabulky pište „+“ a „–“. Pozitivitu charakterizují _____________________, zatímco ____________________ je negativní. Nyní vyplňte v tabulce řádek „Dílčí závěr“. Napište STAF, pokud se kmen ukázal býti stafylokokem, a JINÝ, pokud je to něco jiného. Úkol 6: Testy pro odlišení S. aureus 6a) Test na clumping faktor (test vázané plasmakoagulázy) Na podložní sklíčko kápněte kapku ředěné králičí plazmy. Pomocí sterilní mikrobiologické kličky v ní suspendujte vyšetřovaný kmen stafylokoka. Přítomnost plasmakoagulázy se projeví aglutinací bakteriálních buněk. Výsledek vyšetření zakreslete a zapište sem i do tabulky. Kmen _____ (písmeno) pozitivní – negativní (škrtněte co neplatí) 6b) Plasmakoagulázový test (test volné plasmakoagulázy) Do 0,5 ml 10× ředěné králičí plazmy bylo suspendováno několik kolonií vyšetřovaného kmene stafylokoka. Suspenzi inkubujeme v termostatu při 37 °C. Výsledek se odečítá po 1, 2 a 24 hodinách. Jako pozitivní reakce se hodnotí, pokud dojde ke koagulaci králičí plasmy ve zkumavce, tj. dojde k zrosolovatění celého obsahu zkumavky, příp. alespoň části. Zapište a zakreslete výsledek této reakce u vybraných kmenů po 24 hodinách inkubace. (Zkumavka je v nákresu záměrně nakloněná, aby bylo vidět, zda je uvnitř hladina tekutiny.) Pozitivní výsledek Negativní výsledek Filip Zkumavka Filip Zkumavka 6c) Detekce hyaluronidázy Na krevní agar jsme naočkovali asi 2 cm široký pás Streptococcus equii, bakterie, která tvoří silné pouzdro s obsahem kyseliny hyaluronové. Kolmo k tomuto pásu byla naočkována čára vyšetřovaného kmene stafylokoka. Pokud je příslušným kmenem stafylokoka hyaluronidáza produkována, difunduje do okolí a do druhého dne způsobí lýzu pouzdra Streptococcus equii. To se projeví půlkruhovou zónou „ztráty slizovitosti“ v pásu naočkovaného Streptococcus equii. Zakreslete výsledek reakce u dvou kmenů (včetně pozitivní a negativní kontroly) a popište. Pozor! V tomto úkolu nejde o hemolýzu kmenů. Do obrázku ji sice – pokud ji pozorujete – můžete zakreslit, není to však pro tento úkol podstatné. Dbejte pokynů učitele a úkol provádějte až po jeho výkladu! Úkol 7: Bližší určení stafylokoků pomocí biochemického mikrotestu (STAPHYtest 16) Pro identifikaci stafylokoků je určena sada biochemických testů. Podle tabulky v návodu k použití nebo podle barevné srovnávací šablony odečtěte výsledky jednotlivých reakcí. Výsledky testů pro jednotlivé kmeny zapište a na základě interpretačních tabulek zjistěte, o které druhy stafylokoků jde. Začátek výsledků pro první kmen máte předvyplněn. Nezapomeňte vyplnit též procento pravděpodobnosti a index typičnosti! Zkum. První řádek vlastního testu s 8 jamkami Druhý řádek vlastního testu s 8 jamkami VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A K + + + – – – + + – 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 0 3 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A L + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index Úkol 8a: Citlivost stafylokoků k antibiotikům Zjistěte citlivost předložených kmenů stafylokoků k vybraným antibiotikům pomocí diskového difusního testu. Citlivost k předkládaným antibiotikům zhodnoťte na základě změření průměru inhibiční zóny a porovnání s tabulkou. Interpretujte kmeny jako citlivé (C), intermediární (I) či rezistentní (R) k daným antibiotikům. Kmen Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Cefoxitin FOX* ≥ 22/25 mm** < 22/25 mm** Erythromycin E ≥ 21 mm 18–20 mm < 18 mm Clindamycin DA ≥ 22 mm 19–21 mm < 19 mm Ko-trimoxazol SXT ≥ 17 mm 15–16 mm < 15 mm Tetracyklin*** TE ≥ 22 mm 19–21 mm < 19 mm Chloramfenikol C ≥ 18 mm < 18 mm *interpretuje se jako oxacilin, případně i další betalaktamy **22 mm platí pro S. aureus, 25 mm pro koagulázanegativní stafylokoky ***výsledek platí také pro doxycyklin Důležitá poznámka: V některých testech může být uprostřed sedmý disk MUP (mupirocin). Jde o lokálně podávanou antimikrobiální látku (obsaženou např. v preparátu BACTROBAN) sloužící například k alespoň dočasnému odstranění kmenů MRSA (viz dále) z nosní dutiny. Test citlivosti na mupirocin se provádí zejména při nálezech zlatých slafylokoků z nosu. Protože mupirocin nemají ve svých testech všichni, v praktiku ho nehodnotíme (jen pro informaci, kmen je citlivý při zóně ≥ 30 mm a rezistentní při zóně < 18 mm). – Důsledkem přítomnosti mupirocinu uprostřed je horší odečitatelnost ostatních zón. Pokud není možné změřit průměr, změřte poloměr (odhadněte střed disku) a vynásobte dvěma. Úkol 8b: Demonstrace screeningové půdy na MRSA U předložených kmenů (na bočním stole) ověřte, zda jde o MRSA. (Je možné, že půjde jen o jeden kmen, v tom případě chybějící řádky vynechejte. Kmen Kmen je Staph only MRSA – MRSKN – MS stafylokok* MRSA – MRSKN – MS stafylokok* MRSA – MRSKN – MS stafylokok* *nehodící se škrtněte: MRSA = meticilin rezistentní S. aureus, MRSKN = meticilin rezistentní koagulázanegativní staf., MS = meticilin citlivý