Téma P02-03: Diagnostika streptokoků, enterokoků a G+ tyčinek K nastudování: Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium (z učebnic, internetu…) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace, Neutralizace Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 1 až 5 a 8 až 9 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S T U V W Gramovo barvení – Úkol č. 1 Kultivace – úkol 2 (pište jen základní charakteristiku) Kataláza – úkol 3a Slanetz-Bartley 3b Žluč-eskulin 3c Úkol 4a: Optochin (jen viridující str.) Úkol 5a: PYR test (jen hemolytické s.) Úkol 5b: CAMP (jen hemolytické s.) Úkol 5c (jen nAnB) Aglutinace Úkol 8: arabinóza Úkol 9: Růst na KA při 4 °C KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a rozlište grampozitivní koky a tyčinky a gramnegativní bakterie. U grampozitivních tyčinek si také všimněte uspořádání (palisády), velikosti (drobné, robustní), případně sporulace. Nátěry jednotlivých kmenů označte na sklíčku pomocí dermografu příslušným písmenem. Výsledky zapište do tabulky. S gramnegativní tyčinkou již dále nepracujte. Úkol 2: Kultivace na krevním agaru Na miskách s krevním agarem máte všechny kmeny. Zapište vlastnosti kmenů do tabulky jen nejnápadnější znaky (velikost, barva a především úplná hemolýza / částečná / viridace / nepřítomnost hemolýzy) Úkol 3: Základní kultivační a biochemické testy – rodové určení a) Katalasový test k odlišení stafylokoků Proveďte katalasový test se všemi kmeny z prvního úkolu s výjimkou toho, který jste v tomto úkolu vyřadili. Stafylokoky jsou katalasa pozitivní, streptokoky a enterokoky negativní. Zapište do tabulky. Poznámka: Testování katalázy u G+ tyčinek se může zdát zbytečné, protože Listeria, Corynebacterium i Bacillus jsou v testu pozitivní. Ovšem některé jiné koryneformní tyčinky (např. Arcanobacterium) jsou negativní, a proto má kataláza v diagnostice G+ tyčinek své místo. b) Růst na Slanetz-Bartleyově agaru k odlišení enterokoků Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Rostou však jen dva – enterokoky. Zapište výsledek do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinovém agaru k odlišení enterokoků a listerií Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Rostou však jen tři. V případě G+ koků platí, že tyto kmeny patří mezi enterokoky. U G+ tyčinek by mělo jít o listerii. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 4: Bližší určení streptokoků s viridací a) Optochinový test Máte za úkol vyhodnotit optochinový test u dvou kmenů, které jste určili jako streptokoky s viridací. Optochinový test je test, který se ničím neliší od běžného difúzního diskového testu až na to, že účinná látka (optochin) se nyní už nevyužívá léčebně. Kmen s přítomností zóny inhibice růstu kolem disku je S. pneumoniae, kmen bez zóny je „ústní streptokok“. Výsledek zakreslete a zapište do tabulky (tam stačí ve formě + / –) Jakákoli zóna znamená pozitivitu, absence zóny je negativní. Zónu není třeba měřit. KMEN __ KMEN __ > b) Biochemické určení „ústního“ streptokoka V tomto praktiku se neprovádí. Vizte výklad učitele. (Odečítání je velmi podobné STAPHYtestu 16 z P01) Úkol 5: Určování streptokoků s částečnou či úplnou hemolýzou Tento úkol provádějte u tří kmenů, které jste určili jako streptokoky s úplnou nebo částečnou hemolýzou (části a, b); část c) pouze u kmene, který určíte jako non-A-non-B streptokoka. a) PYR test PYR test je proužkový test, podobný oxidázovému. Při odečítání barevné reakce je však nutno asi pět minut vyčkat, pak přikápnout kapku činidla pro PYR test a poté počkat další půlminutu. Pozitivní je zčervenání otisku. Také tento test je pozitivní u S. pyogenes (a také u enterokoků). Negativní je Streptococcus agalactiae i non-A-non-B streptokoky. Poznámka: Někdejší bacitracinový test se dříve používal místo PYR-testu. Jeho princip je shodný s principem optochinového testu, jen s jiným antibiotikem. Pro nedostatečnou specificitu byl již téměř opuštěn. Vyplňte následující tabulku, včetně zakreslení výsledku PYR testu u všech tří testovaných kmenů. Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Interpretace: negativní – pozitivní nehodící se škrtněte Interpretace: negativní – pozitivní nehodící se škrtněte Interpretace: negativní – pozitivní nehodící se škrtněte b) CAMP test Poznámka: CAMP test nemá nic společného s cyklickým adenosinmonofosfátem. Nazývá se podle jmen svých objevitelů. Proto se také píše CAMP test a nikoli cAMP test. CAMP test je založen na hemolytickém synergismu mezi kmenem S. aureus produkujícím beta-hemolyzin a kmenem S. agalactiae. Pozitivní výsledek má tvar dvou trojúhelníkovitých zón („motýlovitý tvar“) úplné hemolýzy v místě překřížení obou kmenů. Malá zóna jiného tvaru se považuje za negativní výsledek. Negativní je jak S. pyogenes, tak i non-A-non-B streptokoky. Nakreslete svůj výsledek do obrázku (na následující stránce): kmen ___ kmen ___ kmen ___ c) Demonstrace aglutinačního testu k bližšímu určení zejména non-A-non-B streptokoků U kmene určeného jako streptokok non-A-non-B by se mohlo provést určení séroskupiny aglutinací. Prohlédněte si na obrázku z dataprojekce výsledek takové aglutinace a zakreslete. Poté zaznamenejte do tabulky výsledky všech částí Úkolu č. 5, a zapište do tabulky definitivní závěr (určení jednotlivých streptokoků). A C F G D B Úkol 6: Testy citlivosti na antibiotika u streptokoků Vyhodnoťte testy citlivosti (difusní diskové testy) na antibiotika u těch kmenů streptokoků, které považujete za patogeny či možné patogeny; předpokládejme pro jednoduchost, že se jedná o kmeny z horních cest dýchacích. U kmene určeného jako non-A-non-B streptokok pro jeho malou patogenitu citlivost neurčujeme; u kmene určeného jako S. agalactiae (typický původce močových infekcí) použijeme sadu antibiotik určenou pro léčbu močových infekcí (obsahuje např. nitrofurantoin). Interpretujte kmeny jako citlivé (C), intermediární (I) či rezistentní (R) k daným antibiotikům. Kmen Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Penicilin P ≥ 18 mm < 18 mm Erythromycin E ≥ 21 mm 18–20 mm < 18 mm Clindamycin DA ≥ 17 mm < 17 mm Chloramfenikol C ≥ 19 mm < 19 mm Tetracyklin* TE ≥ 23 mm 20–22 mm < 20 mm Vankomycin VA ≥ 13 mm < 13 mm Kmen Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Penicilin P* ≥ 18 mm < 18 mm Tetracyklin* TE ≥ 23 mm 20–22 mm < 20 mm Vankomycin VA ≥ 13 mm < 13 mm Nitrofurantoin F ≥ 15 mm < 15 mm *interpretuje se jako ampicilin Úkol č. 7 Diagnostika pozdních následků streptokokových infekcí – vyšetření ASLO Princip – opakování z J07: Protilátky brání hemolyzinu (streptolyzin O – antigen) hemolyzovat králičí erytrocyty. Hladina ASLO se zvyšuje po nákazách vyvolaných hemolytickými streptokoky skupiny A (méně často i jiných skupin). Riziko pozdních následků streptokokových nákaz se projeví zvýšením ASLO nad 200 m. j. (mezinárodních jednotek). Na bočním stole naleznete ve vlhké komůrce destičku. Obsahuje pozitivní kontrolu a několik sér pacientů. Určete hodnoty ASLO (hodnota ASLO odpovídá poslednímu ještě pozitivnímu důlku; pozitivita = zábrana hemolýzy, negativita = hemolýza) a interpretujte z hlediska rizika pozdních následků streptokokové infekce. Úkol 8: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus faecalis). Výsledek zapište do tabulky na první straně. b) MALDI-TOF pro přesnější diagnostiku enterokoků a koryneformních tyčinek Ačkoli arabinózový test lze považovat za dostatečný pro běžné případy, v některých situacích potřebujeme diagnostiku založenou na více znacích a schopnost detekovat více než dva druhy enterokoků. Podobně termín "koryneformní tyčinky" obvykle představuje dostatečnou úroveň určení korynebakterií a příbuzných bakterií (zejména pokud jsou izolovány z kůže), ale ne pro důležité izoláty (například z krevního oběhu). Jak pro enterokoky, tak i pro koryneformní tyče je možné použít některé biochemické testy. Test na Enterococcus je vyráběn i v Česku ("EN-COCCUStest firmy Erba Lachema"), ale neexistuje žádný test Lachema pro koryneformní tyčinky, takže by bylo zapotřebí použít jiné testy (například API® Coryne od firmy Bio-Mérieux). V poslední době je také možné oba nahradit metodou MALDI-TOF. Ve dvojitém praktiku se úkol neprovádí. Úkol 9: Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Poznámka: Z praktických a časových důvodů vynecháváme testování citlivosti u enterokoků, korynebakterií a listerií. Difusní diskový test se odečítá podobně jako u jiných bakterií. U enterokoků na MH, u G+ tyčinek zpravidla na MH s krvinkami. Slovníček k dnešnímu tématu: V tomto protokolu (a v některých učebnicích) V některých jiných učebnicích viridace alfa-hemolýza částečná hemolýza beta-hemolýza úplná hemolýza žádná hemolýza/nepřítomnost hemolýzy gama-hemolýza