P09
Spirochety
VLLM0522c (podzim 2016)
Osnova
●
spirochety
●
rod Borrelia
●
rod Treponema
●
Leptospira interrogans
●
úkoly
2/28
Spirochety
●
rody Borrelia, Treponema, Leptospira
●
spirální pohyblivé bakterie (axiální bičíky v
periplazmatickém prostoru)
●
buněčná stěna podobná G- bakteriím, ale nebarví se
podle Grama, velice obtížná kultivace
●
mikroskopie v zástinu, fluorescenční mikroskopie
3/28
Rod Borrelia
●
původci lymské boreliózy
– B. burgdorferi sensu lato
●
B. burgdorferi sensu stricto (USA + Evr.; postižení
kloubů a myokardu)
●
B. afzelii (Evr. + Asie; kožní příznaky)
●
B. garinii (Evr. + Asie; neurologické projevy)
●
původci návratných horeček
– B. recurrentis
– B. duttoni
– B. hermsii
4/28
Lymeská borelióza
●
zoonóza, přenos klíšťaty (v ČR Ixodes ricinus),
rezervoár hlodavci, ptáci
●
incidence v ČR: 40/100 000 obyvatel
●
často spontánní uzdravení
●
protilátky asi u 10 % zdravých osob
●
prodělané onemocnění
chrání jen částečně
●
ATB: beta-laktamy,
tetracykliny
5/28
Stádia lymské boreliózy
●
časné lokalizované
– erythema migrans (3–30 dní)
– nespecifické příznaky
●
časné diseminované
– borreliový lymfocytom (uši)
– neurologické, kardiální, revmatologické projevy
●
pozdní diseminované
– chronická encelafomyelitida, artritida
– acrodermatitis chronica atrophicans (degenerace
podkoží, ztenčená kůže)
6/28
Rod Treponema
●
Treponema pallidum
– ssp. pallidum – syfilis (pohl. nemoc, přenos sex.)
– ssp. endemicum – endemická syfilis (bejel) – léze
na ústní sliznici
– ssp. carateum – pinta – kožní léze (Lat. Am.)
– ssp. pertenue – framboesie – kožní léze (Afr., JV
Asie, J. Am.)
●
Treponema denticola – nepatogenní, popř.
periodontitida
7/28
Syfilis (lues)
●
T. pallidum ssp. pallidum
●
klasická pohlavní nemoc (přenos výhradně sexuálně)
●
časná syfilis
– primární (ulcerace v místě vstupu – na genitálu,
ulcus durum, tvrdý vřed
– sekundární (diseminace, horečka, bolesti hlavy,
artralgie, anorexie, generalizovaná vyrážka +
kondylomata – kožní a slizniční léze)
– časná latentní (během 1. roku po překonání
sekundárního stadia, asymptomatické období, možné
relapsy sekundárního stadia)
8/28
Syfilis (2)
●
pozdní
– pozdní latentní (není
epidemiologické riziko,
možné pozdní příznaky)
– terciální
●
gummata – měkké záněty
(nejčastěji játra, kosti, kůže)
●
neurosyfilis – meningitida, progresivní paralýzy,
demence, tabes dorsalis (poruchy polohocitu,
chůze, čití, ...)
●
kardiovaskulární záněty, aneurysma (aorta)
●
vrozená syfilis (potrat nebo sekundární stadium)
9/28
Diagnostika syfilis – přímý průkaz
●
přímý průkaz se provádí zřídka
●
mikroskopie: nativní preparát (mikroskopie v
zástinu, fluorescenční mikroskopie
●
kultivace a biochemie: nepoužívá se
●
průkaz antigenu imunofluorescenčně
●
pokus na zvířeti: rabbit infectivity test (RIT), očkování
do varlat novozélandského bílého králíka (orchitida za
10 dní) – dnes raritní
●
PCR diagnostika
10/28
Diagnostika syfilis – nepřímý průkaz
●
netreponemové testy:
– RRR (rychlá reaginová reakce) RPR (rabbit-plasma
reagin test) VDRL (venereal disease research
laboratory)
– zjišťuje se přítomnost nespecifických protilátek
proti kardiolipinu
– detekovatelné cca 4 týdny po infekci
●
treponemové testy
●
antigen je z T. pallidum
●
TPHA – T. pallidum pasivní hemaglutinační test
(TPPA – T. p. particle agglutination), anti-TP
●
ELISA, FTA-ABS, western blotting
11/28
Přehled testů na syfilis
Historický
BWR – Bordet
Wassermann Netreponemové
Screening
RRR/RPR/VDRL
TPHA/TPPA/anti-TP
Treponemové
Konfirmace
ELISA
FTA-ABS
Western blotting
Historický
(superkonfirmace)
TPIT (Treponema
Pallidum Imobilizační
Test) = Nelson
12/28
Leptospira interrogans
●
jemné závity, na koncích ohnuté
●
nákaza kontaktem s močí infikovaného zvířete –
hlodavci, prase, skot, … (koupání v přírodních vodních
zdrojích, konzumace kontaminované vody)
●
vstup kůží (pravděpodobně i neporušenou) nebo
sliznicemi (typicky spojivkou)
●
serovar Grippotryphosa – polní/žňová/blaťácká
horečka
– chřipkovité příznaky, anikterická forma
●
serovar Icterohemorrhagiae – Weilova nemoc
– nejdříve podobné blaťácké horečce, poté ikterus,
krvácivé projevy na kůži a sliznicích, renální selhání
13/28
Úkol 1: Průkaz protilátek proti
B. garinii metodou ELISA
●
Pacient J: klinicky definované erythema migrans
(jasný obraz, ne jen podezření)
●
Pacient K: cítí se ospalý, v létě měl klíště; jiné potíže
nejsou přítomny
●
Pacient L: neurologové nalezli typické klinické
příznaky neuroboreliózy
●
Pacient M: zdravá osoba, ale v létě měl klíště, a cítí
se ohrožen rizikem borreliózy, protože si přečetl o
tomto riziku.
●
Pacient N: je u něj podezření na neuroboreliózu,
avšak není jasné
14/28
Úkol 1: Průkaz protilátek proti
B. garinii metodou ELISA (2)
●
průkaz protilátek ve třídách IgM a IgG
●
výsledky reakce ve formě absorbance
●
pozitivní hodnoty jsou vyšší než hodnota
kalibrace (CAL) (K+ a K- jsou kontroly, důlky B1 a C1)
15/28
Úkol 2: Průkaz protilátek proti
B. garinii pomocí WB
●
konfirmace pokud je pozitivní reakce ELISA nebo
klinické důvody (J – klinické důvody)
●
pozitivní WB:
– IgM: pozitivita v pruhu p25 a OspC
– IgG: pozitivita v pruhu VlsE
16/28
Úkol 3: Dg. borreliózy pomocí PCR
●
PCR je přímý průkaz (průkaznější než hledání
protilátek) zvláště u čerstvé infekce, kdy ještě nejsou
vytvořeny protilátky
●
k PCR jsou indikováni pacienti L a N
●
pozitivita: svítící proužek
●
IC nebyla použita, vpravo je ladder
17/28
Výsledky úkolů 1-3
ELISA WB PCR
IgM IgG IgM IgG
J (erythema migrans) - - - K
(klíště v létě) - + - +
L (příznaky neurobor.) + + + + +
M (zdravý) - + - +
N (podezření neurobor.) + - - - -
18/28
Závěry k úkolům 1-3
●
J: Nutno léčit doxycyklinem (i přesto, že je
seronegativní, klinické příznaky jsou dostatečně
pádným důvodem k léčbě)
●
K: Zřejmě jen paměťové protilátky, nutná další
diferenciální diagnostika
●
L: Skutečně jde o neuroboreliózu, léčba ceftriaxonem
●
M: Pacient je v pořádku (kdysi možná prodělal
bezpříznakovou borreliózu, 10 % populace má pozitivní
IgG)
●
N: pozitivní IgM v ELISA nepotvrdil WB ani PCR, zřejmě
zkřížená reakce, nutno pátrat po jiných neuroinfekcích
19/28
Úkol 4: Přímý průkaz syfilis
●
rabbit infectivity test (RIT), očkování do varlat
novozélandského bílého králíka (orchitida za 10 dní)
●
zástinová mikroskopie (pozorujeme světlo které se
ohnulo či odrazilo na preparátu)
●
přímá imunofluorescence
(detekce antigenů pomocí
značených protilátek)
20/28
Úkol 5+6:
Nepřímý průkaz syfilis
●
úkolu 5: screening pacientů vybereme ty, které je
třeba konfirmovat
●
úkolu 6: potvrzení dg., konečný závěr
●
vyšetřované osoby:
●
A = těhotná žena (běžný screening, není
zvýšené riziko syfilis)
●
B = pacient s dva dny trvající lézí, která
vypadá jako ulcus durum
●
C = pacient se suspektní lues latens
●
D = dárce krve (pouhý screening)
●
E = dítě s pravděpodobnou vrozenou syfilis
21/28
Úkol 5: RRR a TPHA
●
RRR: pozitivní je důlek se zákalem
●
TPHA
22/28
pozitivní kontrola
negativní kontrola
pacienti 1, 2 a 3
technické důlky negativní kontrola
každého pacienta
vlastní reakce
Úkol 5: RRR a TPHA
●
screeningové reakce se dělají při každém
testování na syfilis (vč. těhotných)
●
screeningové reakce se zpravidla provádějí jen
kvalitativně či semikvantitativně
●
indikace ke konfirmaci:
– jakýkoli pozitivní či alespoň hraniční výsledek
reakce RRR a/nebo TPHA
– přítomnost suspektních lézí na těle, nebo
anamnéza rizikového sexuálního styku (zde i
v případě negativity obou reakcí)
23/28
Úkol 5: RRR a TPHA (výsledky)
RRR TPHA závěr
A (těhotná) + - konfirmace
B (léze) - - konfirmace
C (susp. lues) - +++ konfirmace
D (dárce krve) - - bez konfirmace
E (dítě, vroz. lues) + +++ konfirmace
24/28
Úkol 6: Konfirmace syfilis
●
výsledky reakce FTA-ABS:
25/28
konfirmace se
neprovádí
CBA D E
●
hodnocení reakce ELISA:
– cut off hodnota: (C1 + D1)/2
– IgM: hodnoty vyšší než 0,494 jsou pozitivní
– IgG: hodnoty vyšší než 0,366 jsou pozitivní
●
hodnocení Western blottu: za pozitivní v IgG i v IgM
považujte všechny pásky, na kterých umístění a
uspořádání proužků zhruba odpovídá pozitivní kontrole
Úkol 5+6:
Nepřímý průkaz syfilis (výsledky)
FTA ELISA WB závěr
ABS IgM IgG IgM IgG
A (těhotná) - - - - nejde
o lues (falešně
poz., možná po očkování)
B (léze) - - - - PCR
nutné, u čerstvé
infekce možná
seronegativita
C (susp. lues) + - + - + lues latens
D (dárce) dárce je v pořádku
E (dítě, vroz.
lues)
+ + + + +
kongenitální syfilis,
vyšetřit krev matky
26/28
Úkol 7: Přímý průkaz
Leptospira spp.
27/28
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
popsat spirochety
●
popsat zástupce spirochet, vč. diagnostických postupů,
které vedou k úspěšné identifikaci
●
zhodnotit význam přímých a nepřímých metod
v diagnostice spirochet, vč. vhodnosti jejich použití pro
konkrétní případy
28/28