P04
Diagnostika enterobakterií a
bakteriálních původců
gastrointestinálních infekcí
VLLM0522c (podzim 2017)
Osnova
●
čeleď Enterobacteriaceae
●
rod Campylobacter, rod Helicobacter
●
čeleď Vibrionaceae
●
úkoly
2/33
Čeleď Enterobacteriaceae
●
G- tyčky, většinou pohyblivé (kromě shigel, klebsiel
a Y. pestis),
●
OXI- (KAT+), biochemicky značně aktivní
●
komenzálové, saprofyté, patogeny střevní i
mimostřevní (obligátní i oportunní patogeny)
●
klinicky nejdůležitější čeleď G- tyček
3/33
Čeleď Enterobacteriaceae:
patogeny
●
způsobující celkové (systémové) infekce:
– Yersinia pestis (mor)
– antropopatogenní serovary salmonel (sérovary
Typhi, Paratyphi A, B a C – břišní tyfus)
●
obligátní patogeny způsobující zpravidla střevní infekce:
– zoopatogenní serovary salmonel (sérovary
Enteritidis, Typhimurium – salmonelózy)
– shigely, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis
●
podmíněně patogenní enterobakterie:
– rody Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia,
Enterobacter, ...
4/33
Yersinia pestis
●
původce moru
●
přenašeč: blecha morová (Xenopsylla cheopsis)
●
zdroj: krysy, potkani a jiní hlodavci
●
formy onemocnění:
– dýmějový (bubonický) mor
– plicní forma
– septická forma
5/33
Dýmějový (bubonický) mor
6/33
bubon (zvětšená uzlina) v podpaží
hemoragie a srážení krve →
odtud označení černá smrt
Antropopatogenní salmonely
●
S. enterica spp. enterica sérovary Typhi a Paratyphi
●
septická onemocnění břišní tyfus/paratyfus
●
vstupní branou je trávicí trakt (kontaminovaná voda) →
inkubační doba 10–14 dní →
primární bakteriémie,
vysoké teploty,
silné bolesti hlavy
●
S. Typhi
– antigeny O: 9, 12
– antigeny H: d
– antigeny pouzdra: Vi
●
Widalova reakce (aglutinace) 7/33
Zoopatogenní salmonely
●
S. enterica spp. enterica sérovary Enteritidis,
Typhimurium, aj.
●
fekálně-orální přenos – kontaminované potraviny
(zejména vejce, syrové drůbeží a vepřové maso)
●
salmonelózy (průjmy bez krve, horečka, zvracení, u
oslabených jedinců možná sepse)
●
vysoká infekční dávka (cca 105-108 bakterií) =
nutnost pomnožit se v nějaké potravině
●
S. Enteritidis
– antigeny O: 1, 9, 12
– antigeny H: g, m
8/33
Rod Shigella
●
Shigella dysenteriae, S. flexneri, …
●
fekálně-orální přenos, typická nemoc „špinavých
rukou“, možný i alimentární přenos (voda, mléko, ...)
●
shigelóza = bacilární úplavice/dysenterie (průjmy
s krví a hlenem, horečka, křeče v břiše, zvracení)
●
nízká infekční dávka (cca 102 bakterií)
9/33
Escherichia coli
●
důležitá součást střevní mikroflóry (produkce kolicinů
a mikrocinů), omezuje kolonizaci střeva jinými bakteriemi
●
patogeny ve střevě:
– EPEC (enteropatogenní EC) – novorozenecké průjmy
– ETEC (enterotoxigenní EC) – průjmy (cestovatelské)
– EIEC (enteroinvazivní EC) – krvavé průjmy
– EHEC = STEC (enterohemoragické, shiga-like
toxigenní EC) – hemolyticko-uremický syndrom
(průjem, zvracení, horečka, následuje anémie,
petechie, … až selhání ledvin a neurologické příznaky)
●
zejména sérotyp O157:H7 (dále O26, O55, O111)
●
nízká infekční dávka (< 50 bakterií)
10/33
Escherichia coli (2)
●
patogeny ve střevě:
– EAEC (enteroagregativní EC) – cestovatelské průjmy
– DAEC (difúzně-adherentní EC) – cestovatelské
vodnaté průjmy se zvracením
●
patogeny mimo střevo:
– UPEC (uropatogenní EC)
– kmeny způsobující respirační infekce, sepse, infekce
ran, novorozenecké meningitidy…
●
epidemie v Německu 2011 (EAEC O104:H4, která
získala geny pro shiga toxin od STEC horizontálním
přenosem)
11/33
Escherichia coli (3)
12/33
Rod Klebsiella
●
opouzdřené bakterie
●
Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae
●
nozokomiální patogeny
– infekce močových cest
– pneumonie, sepse
13/33
Rod Proteus
●
Proteus mirabilis, Proteus vulgaris
●
původci močových infekcí
●
typický je plazivý růst (tj. neroste jen v místě
inokulace, ale šíří se po povrchu agaru do stran), tzv.
Raussův fenomén či fenomén příbojové vlny
14/33
Multirezistentní enterobakterie
●
rezistence na větší množství antibiotik
●
častí producenti širokospektrých betalaktamáz typu
ESBL popř. ampC
15/33
Izoláty E. coli
rezistentní
k aminopenicilinům,
rok 2013
Multirezistentní enterobakterie (2)
16/33
Multirezistentní izoláty
K. pneumoniae,
rezistence ke 3. gen.
cefalosporinů,
fluorochinolonům a
aminoglykosidům,
rok 2013
Campylobacter jejuni
●
G- zahnutá tyčka (nepatří mezi enterobakterie), OXI+
●
kampylobakterióza - průběh a závažnost onemocnění
srovnatelná se salmonelózou (nebývá zvracení)
●
fekálně-orální přenos – kontaminované potraviny
(zejména drůbeží maso)
●
speciální kultivace (viz úkol č. 7):
– černá „půda pro kampylobaktery“ (CCDA - charcoalcefoperazone-deoxycholate
agar);
neroste na KA a ENDO
– teplota 42 °C
– zvýšená tenze CO2
– prodloužená kultivace na 48 hodin 17/33
Helicobacter pylori
●
G- zahnutá (spirálovitá) tyčka (nepatří mezi
enterobakterie)
●
v žaludku mohutnou→ ureázovou aktivitou si
upravuje mikroprostředí (využití pro dg.)
●
podíl na vzniku gastroduodenálních vředů
●
speciální půda
(kultivace 5 dní)
18/33
Čeleď: Vibrionaceae
●
G- krátké zakřivené tyčky, pohyblivé, OXI+
●
ve vodě v teplých oblastech
●
Vibrio cholerae – cholera (těžké průjmové
onemocnění, zvracení), sérotypy O1 a O139
●
halofilní vibria:
– V. parahaemolyticus
(gastroenteritis,
krvavé průjmy)
– V. vulnificus
(infekce ran, sepse)
19/33
Diferenciální diagnostika
●
Gramovo barvení pro odlišení G- tyček
●
ENDO: z klinicky významných rostou enterobakterie,
Vibrionaceae a G- nefermentující tyčky (GNFB;
praktikum P06)
●
Hajnova půda pro odlišení GNFB (vše negativní)
●
Oxidáza pro odlišení vibrií (pozor, některé GNFB
mohou mít také pozitivní oxidázu; rod Plesiomonas má
také pozitivní oxidázu, ačkoliv patří do čeledi
Enterobacteriaceae)
20/33
Rozlišení enterobakterií
●
ENDO: možné orientační rozlišení obligátních
patogenů (vetšinou L-) a potenciálních patogenů
(většinou L+)
●
další půdy:
– XLD (salmonely černé, shigely růžové, ostatní
enterobakterie žluté, G+ bakterie jsou inhibovány)
– MAL, Deoxycholát-citrátový (DC) agar (obě půdy
podobné XLD, určené pro enterobakterie)
– CIN pro yersinie
●
biochemické testy (Hajna, MIU, ENTEROtesty aj.)
●
antigenní analýza (zpravidla sklíčková aglutinace)
21/33
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
●
obarvěte podle Grama sedm kmenů (kromě
kmenu N, ten je pro Vás již obarven)
●
jeden z kmenů bude G+, výsledek si poznamenejte,
dále už s ním ale nebudeme pracovat
22/33
Úkol 2: Kultivace na KA a ENDO
●
popište kolonie na KA a ENDO
●
na KA můžete vidět hemolýzu, není ale důležitá pro
diagnostiku
●
nezapomeňte že L+ kmeny mají nejen červené (též
růžovočervené nebo kovový lesk) kolonie, ale i okolní
půdu (jinak je to jen pigment)
●
kmeny, které nerostou ani na jedné z půd a
morfologicky se jeví jako zahnuté mohou být
kampylobakter
– tyčky, které nejsou zahnuté budou probírány až
v dalším z praktik
23/33
Úkol 3: Skupinová dg. G- tyček
rostoucích na ENDO
●
úkol 3a: Hajna – pátráme po GNFB, biochemicky
neaktivním kmenu (tj. celá půda je červená),
pokud je půda žlutá, tvoří kmen fermentuje Glc nebo
Lac, pokud je černá, pak kmen tvoří sirovodík
●
úkol 3b: Oxidáza – pro odlišení vibrií (OXI+) a
enterobakterií (OXI-), GNFB mohou být OXI+ i OXI-
24/33
Úkol 3: Skupinová dg. G- tyček
rostoucích na ENDO - HAJNA
●
Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA)
– štěpení laktózy (A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S (POZ = zčernání půdy)
– tvorba plynu (POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá nahoru)
– očkování vpichem
a tzv. hádkem
25/33
Úkol 4: Další kultivační a
biochemické testy
●
úkol 4a: popište kmeny na XLD (salmonely mají
bledé kolonie s černým středem) a dalších selektivních
půdách
●
úkol 4b: ENTEROtest 16 (17 reakcí: 1. je ONPG,
2. až 9. jsou v prvním řádku, 10. až 17. ve druhém
řádku)
26/33
Úkol 5: Antigenní analýza
●
úkol 5a: vyloučení EPEC (sklíčková aglutinace se
dvěma polyvalentními séry)
– pro detekci 12 serovarů EPEC nonavalentní sérum
(I, II, III) a trivalentní sérum (IV)
– pokud je jedno z nich pozitivní, pokračujeme s
příslušnými trivalentními resp. monovalentními séry
– neužívá se vždy, obyčejně však u obligátních
patogenů (salmonely, shigely, yersinie) a u střevních
izolátů E. coli při podezření na EPEC (děti do 3 let)
nebo STEC
●
úkol 5b: určení sérovaru salmonely (sklíčková
aglutinace se dvěma séry, obě musí být pozitivní;
S. Enteritidis pozitivní tělový antigen 9, bičíkový g, m)
27/33
Úkol 6: test citlivosti na ATB
●
antibiotická citlivost se neurčuje u kmenů ze stolice
(u bakteriálních průjmů podání ATB prodlužuje dobu
vylučování patogenů ze střeva, doporučují se probiotika)
●
antibiotická citlivost se určuje u kmenů z moče
– spektrum testovaných ATB zahrnuje i léky používané
při léčbě močových infekcí (např. nitrofurantoin)
28/33
Úkol 7: Dg. kampylobakterů
●
speciální kultivace:
– černá „půda pro kampylobaktery“ (CCDA charcoal-cefoperazone-deoxycholate
agar);
neroste na KA a ENDO
– teplota 42 °C
– zvýšená tenze CO2
– prodloužená kultivace na 48 hod
●
OXI+ (typicky opožděná pozitivita)
29/33
Úkol 8: Ureázový test
v diagnostice helikobakterů
●
helikobaktery nerostou na běžných půdách (mají
speciální půdu, kultivace 5 dní)
●
využívá se štěpení urey (ureázová aktivita je tak silná,
že můžeme pracovat přímo s odebraným vzorkem
(žaludeční tkáň)
●
POZ = červená
●
NEG = žlutá
30/33
Úkol 9: Dg. čeledi Vibrionaceae
●
mikroskopicky zahnutá tyčka
●
kultivace:
– pomnožení v alkalické peptonové vodě
– pevná půda TCŽS (thiosíran-citrát-žluč-sacharóza)
●
pro biochemickou identifikaci můžeme použít sadu
ENTEROtest 16, ale s jinou maticí
●
antigenní analýza: sérovary O1 a O139
●
další biochemické testování sérovaru O1 (biovary
Classic a El Tor)
31/33
Vibrio sp.
www2.mf.uni-lj.si
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
správně použít dekontaminační metody (dezinfekce,
vyšší stupeň dezinfekce, sterilizace) pro různé druhy
materiálů a situací
●
správně si mýt a dezinfikovat ruce
●
popsat nejdůležitější zástupce čeledí Enterobacteriaceae
a Vibrionaceae a rodů Campylobacter a Helicobacter vč.
diagnostických postupů, které vedou k úspěšné
identifikaci
●
posoudit, kdy je vhodné využít antigenní analýzu
●
jmenovat klinicky nejdůležitější sérovary salmonel,
escherichií a vibrií
33/33