Moderní metody analýzy genomu Úvod CRISPR technológia – princípy a využitie D:\Disk Google\FN_disk D\Loga\CEITEC_logo-text_en_P368.jpg D:\Disk Google\FN_disk D\Loga\FN Brno_modra_obdelnik_maly.JPG •24.9.2018 Veronika Mančíková Moderní metody analýzy genomu - sylabus •24.9. Úvod, CRISPR technológia – princípy a využitie (Mančíková) ú •1.10. Sekvenování nové generace (NGS) – technologické aspekty různých NGS platforem (Tichý) ú •15.10. Příprava knihoven pro sekvenování nové generace (Tichý) ú •29.10. Analýza dat I (Bystrý) • •12.11. Metody pro analýzu nekódujících RNA – miRNA, lncRNA (Mráz) • •26.11. Analýza dat II (Pál) ú •10.12. Aplikace - Využití moderních technologií, design experimentů (Trbušek) 2 •Test na internete • •Aspoň polovica správnych odpovedí 3 Ukončení CRISPR/Cas Kľúč k úspechu genomového inžinierstva: metóda na tvorbu dvojreťazcových zlomov. Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon Exon 2 Exon 3 1 Cielená tvorba dvojreťazcového zlomu Nehomológne spojovanie voľných koncov (NHEJ) Exon 1 Homológna rekombinácia Exon 2 Exon 2 Exon 2 Exon 1 Frameshift mutation Exon 1 Frameshift→ Knock-out Templát (mutácia..)→ Knock-in Reparačný systém buniek – endogénny proces Ako špecificky naštiepiť genóm? …nucleases such as CRISPR, ZFNs and TALENs all rely in cleavage of a target site in the genome to stimulate a DNA repair pathway and elicit a change. This is often a highly efficient process, meaning editing efficiencies can be very high with these systems. They come with an inherent risk however (a risk that varies depending on the system you’re using) which is that the nuclease could in theory cut elswhere in the genome without you knowing about it – and you may end up with off target modifications. Meganukleázy •Najšpecifickejšie restrikčné endonukleázy rozpoznávajúce veľmi dlhé sekvencie (16-40nt), prirodzene sa vyskytujú málo •Sekvencia 18 bp rozpoznaná meganukleázou I-Scel sa náhodne bude nachádzať v genóme 20x dlhšom ako ten ľudský •Umelé vytváranie variant je náročne, nakoľko DNA väzobná a štiepiaca funkcia sú súčasťou jednej domény ZFNs & TALENs •Artificiálne restrikčné enzymy (2 domény): • DNA väzba (Zinc Finger a TALE) • štiepenie (Fok I Nukleáza) • • •Proteínové moduly rozpoznajú DNA sekvenciu a dimerizácia Fok l indukuje štiepenie cieľovej DNA •Rozpoznávajú dlhé úseky báz vhodné na štiepenie na úrovni genómu • Enzym FokI přirozeně se vyskytující u Flavobacterium okeanokoites je restrikční endonukleáza typu IIS (štěpí blízko rozpoznávací sekvence). Je tvořena N-terminální vazebnou doménou a nespecificky štěpící doménou na C-konci. Výhody FokI pro její využití v GI: Rozpoznávaná sekvence je oddělena od sekvence, která je štěpena – to umožňuje izolovat doménu enzymu, která štěpí sekvenčně nespecificky. Tato doména pak může být spojena s doménou zodpovědnou za rozpoznání cílové sekvence. FokI vyžaduje pro svou nukleázovou činnost dimerizaci – zvýší se tím specifita rozpoznání cílového místa. Byly připraveny modifikované FokI, které fungují jen jako heterodimery, což zvyšuje specificitu rozpoznání cílových sekvencí a eliminuje možnost vytváření nespecifického štěpení v případě homodimerů. využívá se pro konstrukci ZFN a TALEN nukleáz Screen Shot 2014-04-03 at 4.49.35 PM.png ľavá ZFN cieľová DNA pravá ZFN cieľová DNA Cleavage by Dimerization ZFNs (1985) •Nová cieľová sekvencia (3-4 nt) = nová doména • •Design časovo náročný • •Miera neúspechu je veľmi vysoká (medzidoménové interakcie) • •Off-target veľmi časté TALENs (2009) •Transcription activator-like effector nuclease • •Opakujúce sa vysoko konzervované „moduly“ 33-34 aminokyselín • •Jednoduchší design ako u ZNFs (každý nukleotid má vlastný modul) • • Screen Shot 2014-04-22 at 5.58.16 PM.png Gram negativní bakterie r. Xanthomonas infikují řadu rostlinných druhů, u nichž mohou způsobovat onemocnění. Injikují svými sekrečními systémy do rostlinných buněk řadu efektorových proteinů včetně TAL efektorů. TAL effectors (Transcription Activator-like effectors) mají několik motivů včetně NLS, proto mohou vstupovat do jádra, kde se vážou na promotorové sekvence a aktivují transkripci rostlinných genů, které napomáhají bakteriální infekci (snížení hladiny Cu, zvýšení hladiny glukózy, …) TAL obsahují v centrální části opakující se sekvence aminokyselin v počtu až 33, které jsou dlouhé obvykle 34 AA. N asparagine G glycin H histidine D aspartate I izoleucin Proteínové systémy •sekvenčná špecifita je daná interakciou DNA-protein •editácia prebieha s presnosťou až 1 nt •Používajú se umelo pripravené nukleázy •Nový cieľ=nový proteín → príprava často zložitá, výsledok nie vždy uspokojivý • 1 2 3 CRISPR/Cas: história •Skromný začiatok ako exotické opakujúce sa sekvencie v bakteriálnom genóme •1987: Ishino et al.: "exotic junk DNA" s neznámou funkciou u E.coli • • •2002: Jansen et al.: v genóme väčšiny baktérií a Archae – CRISPR •Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat •= priame opakovania (21 do 37 bp) rozdelené rovnako dlhými neopakujúcimi sa sekvenciami (medzerníky=spacery) -CRISPR asociated (cas) genes – vždy prítomné pri CRISPR lokuse •2005: Mojica et al.: sekvencia spacerov homológna k bakt. fágom • Screen Shot 2014-04-21 at 1.10.25 PM.png 29 nukleotidov homologickych medzi sebou, oddelenych spacerami 32 nukleotidovymi -objavene při studovani iap genu bakterialneho (The iap gene in Escherichia coli is responsible for the isozyme conversion of alkaline phosphatase. We analyzed the 1,664-nucleotide sequence of a chromosomal DNA segment that contained the iap gene and its flanking regions. ) Crispr sa pouzival na genotypizaciu bakteriálních kmenov. A major addition to the understanding of CRISPR came with Jansen's observation that the prokaryote repeat cluster was accompanied by a set of homologous genes that make up CRISPR-associated systems or cas genes. Four cas genes (cas 1 - 4) were initially recognized. The Cas proteins showed helicase and nuclease motifs, suggesting a role in the dynamic structure of the CRISPR loci.^[27] In this publication the acronym CRISPR was coined as the universal name of this pattern. However, the CRISPR function remained enigmatic. CRISPR: bakteriálna imunitná pamäť Screen Shot 2014-04-21 at 1.20.12 PM.png Science, 2007 Výskum uskutočnený v spoločnosti DANISCO. Kontaminácia fágmi je najzávažnejší problém vo fermentačnom priemysle (jogurty a syry). Screen Shot 2014-04-21 at 1.21.43 PM.png •Infekčné experimenty s Streptococcus thermophilus a lytickými fágmi •Rezistentné bakt. kmene sa objavujú po fágovej pandémii → hypotéza: „Bakteriálna získaná imunita proti infekcii fágmi?” CRISPR: bakteriálna imunitná pamäť Screen Shot 2014-04-21 at 1.23.45 PM.png •Čím viac spacerov, tým vyššia odolnosť voči infekcii •Cudzorodá DNA rozpoznaná a začlenená do CRISPR lokusu ako nový medzerník (spacer) •Cas gény-helikázové a nukleázové motívy→aktívna účasť na prestavbe CRISPR lokusu The Cas proteins showed helicase and nuclease motifs, suggesting a role in the dynamic structure of the CRISPR loci. CRISPR: bakteriálna imunitná pamäť Screenshot 2014-04-23 16.41.45.png Nové spacery sú homológne ku genómu fágov. CRISPR: bakteriálna imunitná pamäť Ak vložíme nový spacer do bakt. genómu, bude táto rezistentná? Screenshot 2014-04-23 10.02.29.png •spacery majú schopnosť poskytnúť fágová rezistencia de novo •samotné spacery nie sú dostačujúce, musia byť v konkrétnom genetickom kontexte •niektoré cas gény sú nevyhnutné k poskytnutiu rezistencie (cas9) Posledny bod: fagy co prekonaju CRISPR imunitu CRISPR: bakteriálna imunitná pamäť •relatívne malá populácia bakteriofága si zachovala schopnosť infikovať mutanty → tieto fágy zmutovali sekvenciu korešpondujúcu spaceru → imunita závisí na zhode v sekvencii Posledny bod: fagy co prekonaju CRISPR imunitu CRISPR: bakteriálna imunitná pamäť •crRNA - cieli komplex k DNA •tracrRNA •Cas9 – DNA endonukleáza • •PAM - protospacer adjascent motif • →komplex štiepi vždy 3 nukleotidy od PAM 3 hlavní složky systému – crRNA, tracrRNA, operon Cas proteinov (1-2) Úseky cizorodé DNA jsou začleněny do bakteriálního genomu do lokusů CRISPR Lokusy CRISPR jsou přepsány a upraveny do crRNA (crRNA biogenese) Během interference vytváří endonukleáza Cas9 komplex s crRNA a tracrRNA, který pak štěpí cizorodou DNA obsahující sekvenci 20-ti nukleotidů komplementárních k crRNA poblíž sekvence PAM. PAM sekvence – photospacer adjacent motif - sekvence v těsném sousedství s cílovou DNA sekvencí -nutná pro účinné štěpení Cas9 nukleázou Adaptive immunity occurs in three stages [for recent reviews, see: (i) insertion of a short sequence of the invading DNA as a spacer se- quence into the CRISPR array; (ii) transcription of precursor crRNA (pre-crRNA) that undergoes maturation to generate individual crRNAs, each composed of a repeat portion and an invadertargeting spacer portion; a nd (iii) crRNA-directed cleavage of foreign nucleic acid by Cas proteins at sites complementary to the crRNA spacer sequence. CRISPR-RNA (crRNA), which later guides the Cas nuclease to the target during the interference step, must be generated from the CRISPR sequence. CRISPR/Cas systémy •90% archae a 1/2 baktérií má nejakú formu CRISPR/Cas imunity. CRISPR-Cas systems fall into two classes. Class 1 systems use a complex of multiple Cas proteins to degrade foreign nucleic acids. Class 2 systems use a single large Cas protein for the same purpose. Rekonštitúcia CRISPR/Cas9 in vitro a v nepríbuznom organizme •3 zložky sú potrebné na funkciu in vitro (crRNA, tracrRNA, Cas9) •crRNA a tracrRNA sa môžu skombinovať do jednej guide RNA (sgRNA) • •sgRNA je krátka syntetická RNA zložená z "kostry" nevyhnutnej pre väzbu Cas9 a užívateľom definovanej ~20 nukleotidovej "spacer" alebo cieliacej sekvencie 2012: Tieto zistenia otvorili cestu pre prípravu univerzálnych programovateľných RNA-riadených DNA endonukleáz. „Praktická príručka“ Cas9 •Rôzne ortológy (podľa bakt.kmeňa pôvodu, najpoužívanejšia Streptococcus pyogenes Cas9) •Multifunkčný proteín - 2x nukleázová doména (HNH, RuvC-like)-každá štiepi iný DNA reťazec - helikázová doména •Off-target = tolerancia Cas9 k nesprávnemu párovaniu s cieľovou sekvenciou -Počet nespárovaných bází -Ich umiestnenie vrámci sekvencie -Ich distribúcia vrámci sekvencie -Množstvo Cas9 v bunke (↑Cas9 = ↑ off-target) Modifikácie Cas9 •nCas9 - Mutant pre jednu z dvoch nukleázových domén (Cas9 nickase) - 50 - 1500x vyššia špecifita •dCas9 - katalyticky neaktívny mutant (Cas9 dead) - RNA riadený DNA väzobný proteín - slúži ako výborná platforma na nábor proteínov k cieľovej DNA Cas9 Wild type Cas9 Nickase Dvojreťazcové zlomy Štiepi iba jeden reťazec Vyžaduje single gRNA Vyžaduje 2 gRNAs Off-target Menej off-targetov Vysoká efektivita Špeciálne výkonná pre indely (= KO) Efektivita určená „slabšou“ gRNA Výber gRNA - 2 kritické časti: •5´ koniec (20nt) viaže cieľovú genómovú DNA (100% homológia v „seed“ regióne – 8-12nt) - Genómový cieľ môže byť akákoľvek DNA sekvencia (~20nt) -táto sekvencia je jedinečná -sekvencia bezprostredne pred Protospacer Adjacent Motif (PAM, sekvencia špecifická pre jednotlivé druhy Cas9, napr. 5′ NGG 3′ u Streptococcus pyogenes Cas9) • • •3´ koniec sa viaže na Cas9 (špecifický pre rôzne ortológy Cas9, pre jeden otrológ rovnaký pre rôzne sgRNA) • -Schopnosť multiplexovaného cielenia viacerých génov - -sgRNA sa navrhujú pomocou in silico softwarov - Výber génu (organizmu), Cas enzýmu… •Výber gRNA štruktúry ovplyvňuje aktivitu Cas9 - Duálna gRNA ( crRNA a tracrRNA exprimované separátne) – väčšinou nižšia účinnost - Single gRNA Rekonštitúcia dvojkomponentového CRISPR/Cas9 •CRISPR/Cas9 systém vyžaduje ko-expresiou 2 komponentov: sgRNA špecifickej pre cieľový gén a endonukleázu Cas9 (na jednom/dvoch vektoroch) • -Jednovektorový systém (napr. lentiCRISPRv2) – plasmid s 2 expresními kazetami (Cas9 a chimérna gRNA). Plasmid môže byť naštiepený restrikčným enzýmom v lokuse gRNA, a do miesta štiepenia vložená cieliaca oligosekvencia (20nt). • - vhodný napr. pre primárne bunky (iba jedna transdukcia) - - -Dvojvektorový systém (napr. lentiGuide-Puro a lentiCas9-Blast) – 1 plasmid exprimuje len gRNA, druhý Cas9 (najprv sa zavedie Cas9). Plasmid môže byť naštiepený restrikčným enzýmom v lokuse gRNA, a do miesta štiepenia vložená cieliaca oligosekvencia (20nt). - CRISPR/Cas9 editovanie: potrebné komponenty •ko-expresia sgRNA a Cas9 → špecifický expresný systém závisí od konkrétnej aplikácie • Expresný systém komponenty systému aplikácia Savčie expresné vektory •Promótor Cas9 konštitutívny (CMV, EF1alfa) alebo indukovateľný (Tet-ON); Promótor gRNA typicky U6 •Reportér. gén (GFP), selekčný marker (antibiotikum) Ľahko transfekovateľné bunky (Hek293), dočasná alebo stabilná expresia Lentivirálna transdukcia •Cas9 a sgRNA na 1/2 vektorech •Reportér. gén (GFP), selekčný marker (antibiotikum) •Obalové plazmidy na tvorbu víru •Stabilná, laditeľná expresia Cas9 a/alebo gRNA v širokej škále savčích línií •Užitočné pre ťažko transfekované bunky/in vivo •Celogenómové screeningy Cas9 mRNA a gRNA Plazmidy s gRNA a Cas9 sa použíjú na transkripciu in vitro na vytvorenie maturovej Cas9 mRNA a gRNA, potom sa dodajú do cieľových buniek (napr. mikroinjekcia alebo elektroporácia) •Dočasná expresia systému •Expresia klesá s časom (degraduje sa RNA) •Generovanie transgénnych embryí Cas9-gRNA riboproteínový komplex Purifikovaný Cas9 proteín a in vitro transkribovaná gRNA sa kombinujú za vzniku komplexu Cas9-gRNA a dodávajú sa do buniek použitím katiónových lipidov •Dočasná expresia systému •Expresia klesá s časom (degradácia komplexu) Prehľad rôznych aplikácií •Indel (knock-out) pomocou NHEJ • •Špecifická zmena (mutácia/insercia) pomocou HR • • •Dvojica gRNA môžu stimulovať veľké delécie, a chrom. prestavby • • •dCas9 fúzovaný s transkripčným regulátorom→ zmena expresie cieľového génu • •dCas9 fúzovaný s rôznymi efektormi → zmeny v epigenetických značkách • •dCas9 fúzovaný s florescenčným proteínom → florescenčná mikroskopia dCas9 = kataliticky neaktívny proteín cvcv CRISPR interference & activation (CRISPRi&a) •dCas9-sgRNA môže blokovať RNA polymerázu •zabrániť iniciácii transkripcie narušením viazania transkripčného faktora •↑ represia s KRAB, SID4X doménami •KRAB-dCas9 silná represia -50 až +300bp od TSS • • • •CRISPRa používa dCas9 fúzne proteíny na nábor transkripčných aktivátorov •často potrebné viaceré sgRNA •Aktivácia -50 až -400bp od TSS By pairing dCas9 with a sequence-specific sgRNA, the dCas9–sgRNA complex can interfere with transcription elongation by blocking RNA polymerase (Pol). It can also impede transcription initiation by disrupting transcription factor binding15,30,36,37 (FIG. 1b). CRISPRmediated gene activation, termed CRISPRa, uses dCas9 fusion proteins to recruit transcription activators. Simultánna transkripčná aktivácia a represia •Viaceré sgRNA→viac génov • •scRNA (scaffold)-predĺženia sgRNA o proteíny-viažúce RNA adaptéry→info o cieľovom géne a akcii (ON/OFF) Manipulácia komplexných signálnych dráh (bez zmien v sekvencii DNA). By pairing dCas9 with a sequence-specific sgRNA, the dCas9–sgRNA complex can interfere with transcription elongation by blocking RNA polymerase (Pol). It can also impede transcription initiation by disrupting transcription factor binding15,30,36,37 (FIG. 1b). CRISPRmediated gene activation, termed CRISPRa, uses dCas9 fusion proteins to recruit transcription activators. CRISPR editácie báz (bez DSB): CRISPRx a iné •Cas9 varianty / cytidín deaminázy / manipulácia DNA reparačného systému buniek → špecifická editácia bez DSB • Viaže DSB→↓viabilita buniek s DSB By pairing dCas9 with a sequence-specific sgRNA, the dCas9–sgRNA complex can interfere with transcription elongation by blocking RNA polymerase (Pol). It can also impede transcription initiation by disrupting transcription factor binding15,30,36,37 (FIG. 1b). CRISPRmediated gene activation, termed CRISPRa, uses dCas9 fusion proteins to recruit transcription activators. CRISPR editácie báz (bez DSB): CRISPRx a iné •Cas9 varianty / cytidín deaminázy / manipulácia DNA reparačného systému buniek → špecifická editácia bez DSB • →precízne jednonukleotidové zmeny →miestna diverzifikácia sekvencie nikáza Targeted AID-mediated mutagenesis Schopnosť generovať bodové mutácie na cytosínových a guanínových nukleotidoch s nízkou frekvenciou indelov. 3000 genetických variant v ClinVar by bolo opravitelných C>T substitúciou By pairing dCas9 with a sequence-specific sgRNA, the dCas9–sgRNA complex can interfere with transcription elongation by blocking RNA polymerase (Pol). It can also impede transcription initiation by disrupting transcription factor binding15,30,36,37 (FIG. 1b). CRISPRmediated gene activation, termed CRISPRa, uses dCas9 fusion proteins to recruit transcription activators. AID (activation induced cytidine deaminase)-diversifikacia protilatok cez somaticku hypermutaciu Aplikácie: výhody a nevýhody CRISPR/Cas Kľúčové aspekty pri úprave génu CRISPR/Cas üJe vhodná? ü üJe esenciálny/exprimovaný/amplifikovaný? ü üKnock-in vs knock-out/represia vs aktivácia ü üEfektívnosť vs špecifickosť ü ü Maximalizácia efektivity ü ü Koľko klonov potrebujem na nájdenie pozitívneho? ü ü Je výsledok podľa očakávaní? ü Validácia •DNA -priame sekvenovanie -T7 endonukleázová assay -Restrikčná assay -Mutácia homozygotná?, indel násobky 3? - •mRNA • •proteín • WT Cas9/sgRNA Optimálne je potrebné vylúčiť off-target (NGS). Experimentálne stratégie na vylúčenie off-target •Vylúčenie potenciálnych co-founder efektov off-target mutácií • -spätné vloženie wild-type alely by malo zvrátiť fenotyp • •Použitie viacerých sgRNA • -každá sgRNA má iné potenciálne off-targety, ak je fenotyp rovnaký u viacerých sgRNA, zrejme sa nejedná o off-target efekt •In silico návrh gRNA •Objednanie oligonukleotidov •Molekulárne klonovanie •Transformácia baktérií •(tvorba víru) •Vloženie systému •Selekcia (antibiotikum, GFP) •Validácia editácie •Tvorba izogénnych línií z jednobunečných klonov „CRISPR goes viral“ Rat August 2013 Zebrafish January 2013 Xenopus October 2013 Pig January 2014 Rabbit January 2014 Rice fish April 2014 Silkworm December 2013 Drosophila September 2013 „Technika, ktorá dokáže presne meniť genómy všetkého od pšenice až po slony.“ CRISPR… proste funguje (lepšie). Screen Shot 2014-04-21 at 2.34.56 PM.png U TALENu každá nová target sekvencia vyžaduje značnú zmenu v proteínovej štruktúre TALENu, CRISPR/Cas vyžaduje len zmenu 20nt v sgRNA. CRISPR •sekvenčná špecifita je daná interakciou DNA-RNA •editácia prebieha s presnosťou až 1 nt •veľmi efektívna editácia (hlavne na indel) •možnosť multiplexného cielenia •nový cieľ=nová gRNA → príprava menej ako týždeň •20-40$/gén (4000$ za TALEN) • • Aplikácie Aplikácie: (1) terapia genetických chorôb •Tisíce monogénnych chorôb (napr. hypertrofická kardiomyopatia - gén MYBPC3, incidencia 1:5000) •24/8/2017, Nature: Mutácia=4nt delécia sgRNA cielená na túto deléciu •Etické aspekty •Off-target efekt (latentné problémy) •„Designer babies“ •Do budúcnosti zníženie genofondu (?) The effort, led by Shoukhrat Mitalipov of Oregon Health and Science University, involved changing the DNA of a large number of one-cell embryos with the gene-editing technique CRISPR. Therefore, we specifically targeted the heterozygous four-base-pair (bp) deletion in the MYBPC3 gene in human zygotes introduced by heterozygous, carrier sperm while oocytes obtained from healthy donors provided the wild-type allele. Two single-guide RNA (sgRNA)–Cas9 constructs were designed to target this specific MYBPC3∆GAGT deletion Here we describe the correction of the heterozygous MYBPC3 mutation in human preimplantation embryos with precise CRISPR–Cas9-based targeting accuracy and high homology-directed repair efficiency by activating an endogenous, germline-specific DNA repair response. Induced double-strand breaks (DSBs) at the mutant paternal allele were predominantly repaired using the homologous wild-type maternal gene instead of a synthetic DNA template. By modulating the cell cycle stage at which the DSB was induced, we were able to avoid mosaicism in cleaving embryos and achieve a high yield of homozygous embryos carrying the wild-type MYBPC3 gene without evidence of off-target mutations. Aplikácie: (1) terapia genetických chorôb Screenshot 2014-04-23 10.52.03.png The effort, led by Shoukhrat Mitalipov of Oregon Health and Science University, involved changing the DNA of a large number of one-cell embryos with the gene-editing technique CRISPR. Therefore, we specifically targeted the heterozygous four-base-pair (bp) deletion in the MYBPC3 gene in human zygotes introduced by heterozygous, carrier sperm while oocytes obtained from healthy donors provided the wild-type allele. Two single-guide RNA (sgRNA)–Cas9 constructs were designed to target this specific MYBPC3∆GAGT deletion Aplikácie: (2) úschovňa dát •V CRISPR lokuse sa ukladá informácia od napadajúcich vírusov (až niekoľko 100 spacerov) → potenciál ukladať aj akúkoľvek inú informáciu •Možnosť zakódovať informáciu do oligonukleotidovej sekvencie (protospacera), a zapísať ju do genómu baktérií a vytvoriť tak „živú úschovňu“ Pixet=súbor pixelov Shipman et al.: CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria, Nature 2017 Tento systém bude schopný zaznamenávať viacrozmerné biologické informácie. Ulozili hodnoty pixelov v nukleotidovom kóde, rozdelených na mnoho samostatných syntetických oligonukleotidovych protospacerov. Tieto oligonukleotidy sme elektroporovali do populácie baktérií, z ktorých každá nesie funkčné CRISPR a nadmerne exprimuje komplex integrázy Cas1-Cas2, čo umožňuje bunkám vloziť oligonukleotidy do ich genómu. 21 možných farieb pixelov bolo zakodovanych degenerovanou nukleotidovou tripletovou tabuľkou. Aby sme rozosielali informácie medzi viacerými protospacermi, poskytli sme každému protospaceru čiarový kód, ktorý definoval, ktorý pixelový súbor (označený ako "pixet") bol kódovaný nukleotidmi v tomto oddelení. Štyri nukleotidy definujú každý pixet a pixely daného pixetu sú rozdelené po celom obrazku. Aplikácie: (3) kontrola infekčných chorôb •Malária, dengue – kontrola nosičov týchto chorôb (komáre) • - kmeň komárov, ktorý je vďaka CRISPR/Cas editácii rezistentný na maláriu, a táto rezistencia sa prenáša na potomstvo • - Cas9 je exprimovaná iba v zárodočnej línii, kde kopíruje gén rezistencie z jedného chromozómu na druhý s ≥ 98% účinnosťou, pričom zachováva transkripčnú aktivitu génov • - transgén je takto veľmi rýchlo rozšírený do potomstva • •HIV – využitie CRISPR/Cas9 na štiepenie vírového genómu v infikovaných bunkách Gantz et al.: Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi, PNAS 2015 protilátky proti malárií ↓ ↓ ↑ Promotor na expresiu v zárodočnej línii CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated genome editing provides a promising cure for HIV-1/AIDS; however, gene delivery efficiency in vivo remains an obstacle to overcome. Here, we demonstrate the feasibility and efficiency of excising the HIV-1 provirus in three different animal models using an all-in-one adeno-associated virus (AAV) vector to deliver multiplex single-guide RNAs (sgRNAs) plus Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9). The quadruplex sgRNAs/saCas9 vector outperformed the duplex vector in excising the integrated HIV-1 genome in cultured neural stem/progenitor cells from HIV-1 Tg26 transgenic mice. Intravenously injected quadruplex sgRNAs/saCas9 AAV-DJ/8 excised HIV-1 proviral DNA and significantly reduced viral RNA expression in several organs/tissues of Tg26 mice. In EcoHIV acutely infected mice, intravenously injected quadruplex sgRNAs/saCas9 AAV-DJ/8 reduced systemic EcoHIV infection, as determined by live bioluminescence imaging. Additionally, this quadruplex vector induced efficient proviral excision, as determined by PCR genotyping in the liver, lungs, brain, and spleen. Finally, in humanized bone marrow/liver/thymus (BLT) mice with chronic HIV-1 infection, successful proviral excision was detected by PCR genotyping in the spleen, lungs, heart, colon, and brain after a single intravenous injection of quadruplex sgRNAs/saCas9 AAV-DJ/8. In conclusion, in vivo excision of HIV-1 proviral DNA by sgRNAs/saCas9 in solid tissues/organs can be achieved via AAV delivery, a significant step toward human clinical trials. Aplikácie: (4) príprava modelov (línií, organizmov) •Oproti klasickým technikám, kedy príprava Knock-out / knock-in myši trvá najmenej 6 ~ 12 mesiacov, CRISPR/Cas9 je bleskurýchly = už za 2 mesiace (navyše odpadá nutnosť ESC) •Prekvapujúco vysokú účinnosť pri produkcii jednoduchých (95%) a dvojitých mutantov (70-80%) myší priamou injekciou mRNA Cas9 a sgRNA do oplodnených zygot •U bunečných línií otázka týždňov – možnosť pripraviť izogénne línie •Možnosť študovať vo veľkom merítku kauzálne mutácie, či varianty objavené v GWAS Aplikácie: (5) celogenómový screening •študovať funkciu génov na celogenómovej úrovni •napr. GeCKO knižnica = lentivírusová knižnice CRISPR-Cas9 proti 18 080 génom s 64 751 jedinečnými sgRNA (3 - 4 sgRNAs na gén, sústredené v 5´ konštitutívnych exónoch) umožňuje skríning negatívnych aj pozitívnych selekcií v ľudských bunkách. Shalem et al.: Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells, Science 2014 •úplne narušuje cieľové gény čím sa predchádza slabým signálom (ako u RNAi) •cielenie génov systémom CRISPR presnejšie a generuje menej off-targetov •výborné na systematické štúdium gén. funkcií •výborný spôsob na získanie informácií o tom, ktoré gény zohrávajú príčinnú úlohu v danom fenotype (hypothesis-free prístup) • Ako sa očakávalo, odhalilo sa hlboké sekvenovanie 14 dní po transdukcii významné zníženie rozmanitosti sgRNA v prežívajúcich bunkách A375 a HUES62. Analýza obohatenia génom stanovila, že väčšina ochudobnených sgRNA sa zameriava na základné gény, ako sú ribozomálne štrukturálne zložky Aplikácie: (5) celogenómový screening •Drop-out screening na odhalenie genetickej zraniteľnosti Tzelepis et al.: A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia, Cell 2016 •Odhaliť esenciálne gény pre široké spektrum ľudských ochorení. •Mnohé z nich by mohli byť úspešne použité na terapiu. • 5aml bunecnych linii, a 2 fibroblasty, 2 biologicke repliky z kazdej. Nainfikovane knihovnou, 30 dni nechane rast, a potom sa detekovali geny, ktore vypadli, a teda su esencialne. Aplikácie: (6) agrikultúra – potlačenie chorobnosti, a iné modifikácie •Napr. ošípané, ktoré sú odolné voči vírusovým ochoreniam, ale aj rastliny (napr. ryža, kukurica...) • • • • • •Sterilita •Viac svalovej hmoty •Zvieratá bez rohov Regulácia ohľadom zvierat a rastlín modifikovaných CRISPR... mali by byť regulované rovnakým spôsobom ako iné geneticky modifikované organizmy, aj keď neobsahujú DNA z iných druhov? Aplikácie: (7) „de-extinction“ • • • •Pomocou CRISPR transformovať slony na mamuty •(neetické implantovať editované embryá do ohrozených slonov ako súčasť experimentu) • • • • • • •Holub sťahovavý (Ectopistes migratorius) z moderných holubov • Porovnať genóm vyhynutého druhu a jeho najbližšieho príbuzného druhu → multiplexný CRIPSR/Cas systém Mamuty vyhynuli kvoli lovu once-ubiquitous bird that was driven to extinction in the late nineteenth century by overhunting. Limitácie & Budúcnosť •Nedoriešené otázky regulácie a etiky • • • • • •Minimalizácia off-target (napr. dvojica gRNA-dCas9 + Fok I), a stratégie na ich odhalenie • •Zlepšenie expresných systémov (expresia len v istých tkáních, vývojových štádiách…) • •Zvýšenie efektivity HDR oproti NHEJ • • • HDR is restricted to the late S and G2 phases (synchronizovat bunky), vyradit NHEJ (napr malymi inhibitormi) Ďakujem za pozornosť. Otázky? Tento projekt získal finanční prostředky z programu pro výzkum a inovace Horizont 2020 Evropské unie v rámci akcí Marie Skłodowska-Curie a je spolufinancován Jihomoravským krajem dle GA č. 665860. Tento materiál odráží pouze postoje autora a EU není odpovědná za jakékoli možné použití informací obsažených v takovém materiálu.