IMUNOLOGIE V ZUBNÍM LÉKAŘSTVÍ 4 (2018) Mikroorganismy a imunitní systém. Mikrobiota a mikrobiom Imunologické aspekty zubního kazu Vakcíny a vakcinace Prof. J. Lokaj Základní fyziologickou funkcí imunitního systému je obrana proti patogenním mikroorganismům. Imunoprevence – vakcinace Imunoterapie – substituce, modulace Ekologické interakce mikrobů a hostitele Parasitismus Komensalismus Mutualismus PATHOBIONT – PATHOGEN …Člověk hned po narození už není jen sám sebou. Lidský organismus se stává gigantickým sídlištěm pro miliardy mikroorganismů. Soužití hostitele s mikroorganismy je výsledkem oboustranných adaptací, které se v průběhu věků neustále vyvíjely a zdokonalovaly… Jiří Kruml a Ivo Miler: Život bez mikrobů (Orbis, Praha, 1975) Terminologie Microbiota (dříve mikroflóra): společenství mikroorganismů v různých místech hostitele Mikrobiom: původně kompletní set genů v mikrobiotě, hromadný genom mikrobů žijících v a na nás, nyní mikrobiota a její veškerý genetický materiál Mikrobiota obsahuje 1014 bakteriálních buněk, tj. 10x více než je buněk, které tvoří naše tělo. (Jsme tedy z více než 90% „mikrobiální“). Počet genů našeho mikrobiomu převyšuje 150x počet genů v lidském genomu. (V lidském trávicím traktu je 3,3 milionu genů z více než tisíce druhů mikrobů (lidský genom má 20-25000 genů). Gilbert JA et al.: Current understanding of the human microbiome (Nature Medicine 2018; 24(4): 392 -400): Podle nových výzkumů je poměr bakterií k lidským buňkám cca 1,3: 1 a jejich genů cca 2 miliony k 20 000). RIKEN, 2016 Ovlivnění skladby mikrobiomu • porod • kojení • strava • infekce • antibiotika • hygienická opatření • kontakt se zevním prostředí Člověk a jeho mikroby „superorganismus“ „kompletní já“ Molekulární biologické metody při studiu mikrobioty • 16S rRNA – kódující geny • Metagenomická analýza – sekvenování veškeré mikrobiální DNA komplexního společenstva • Analýza transcriptomu, proteomu, metabolomu Mikrobiom člověka Wendy S. Garrett J Cell Biol 2015;210:7-8 © 2015 Garrett Mikrobiom: Archaea Jednobuněčné mikroorganismy • „extremofilní“ (hyperthermofilní,hyperacidofilní, hyperhalofilní • mesofilní • některé druhy mají charakteristický metabolismus - methanogenesi. V lidském trávicím traktu se vyskytují: Methanobrevibacter smithii Methanosphaera stadtmanae Methanobrevibacter oralis Biologický význam je tč. studován. Archaea představují novou skupinu probiotik (archaeobiotika) (Gaci N et al: World J Gastroenterology 2014; 20(43): 16062-16078) Mikrobiom: Bakterie Firmicutes: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus…. Bacteroidetes: Bacteroides, Flavobacteria … Actinobacteria: Corynebacterium, Propionibacterium…. Proteobacteria: E. coli, Proteus …. Mikrobiom: Houby Aspergillus, Alternaria, Candida, Cladosporium, Cryptococcus, Fusarium, Malassezia, Rhodotorula, Sacharomyces ….. Mikrobiom - Virom Bakteriofágy, vč. temperovaných (cca 1200 virotypů) Breitbart M et al.: Matagenomic analyses of an uncultured viral community from human feces. (J Bacteriol 2003; 185: 6220-6223) Viry eukaryontů (adenoviry, rotaviry, enteroviry, noroviry, Bocavirus, Picobirnavirus, Cosavirus, Anneloviridae) Reyes Aet al.: Going viral: next generation sequencing applied to phage populations in the human gut. (Nature Rev Microbiol 2012; 10: 607-617) Rozmanitost mikroorganismů v lidském těle OTU, operational taxonomic unit. Fyziologická mikrobiota Význam střevní mikrobioty • Zábrana usídlování patogenních mikrobů. • Lokální produkce antimikrobiálních působků. • Stimulace tvorby Treg (Bacteroides fragilis) • Tvorba vitaminů B12, K • Degradace komplexních polysacharidů ( Bacteroides • thetaiotaomicron) • Tvorba a sekrece imunoglobulinů • Regulace hematopoézy • Rozvoj „MALT“ • Maturace imunitního systému • Regulace hematopoézy • Ovlivňování neurohormonálních procesů Fyziologická mikrobiota indukuje tvorbu „přirozených protilátek“ • Isohemaglutininy (anti A, B) • Xenoaglutininy (např. anti aGal) • Protilátky proti antigenům mikrobioty Nízká séroreaktivita proti některým mikrobům (např. Firmicutes, Proteobacteria) v raném dětství je asociována s vývojem alergie v pozdějším období). Christman et al. JACI 2015 „Hygienická“ hypotéza Strachan DP: Hay fever, hygiene, and household size (BMJ 1989; 299: 1259-1260) Imunologicky nezralý jedinec Genetická predispozice • Industrializovaná společnost •„Aseptické“ prostředí • Antibiotika • Limitované spektrum bakterií v mikrofloře •Život na venkově •Časná kolonizace (enterobacteriacae, laktob.) •Jesle •Parazitární infekce Lymfocyty Treg Vysoké riziko alergií Lymfocyty Th2 (Umetsu et al., 2002) Nízké riziko alergií Dlouhodobé působení probiotik (E. coli - Colinfant) na imunitní systém dětí Opakovaná orální aplikace nepatogenního kmene E. coli po porodu redukovala výskyt alergií v pozdějším věku (10 a 20 let) After 10 years Colonized infants (n = 77) 12%* (9) Control infants (n = 55) 33% (18) After 20 years Colonized infants (n = 150) 16% (24) Control infants (n = 144) 32% (46) *p < 0.01 Clin. symptoms Mikroby a autoimunitní choroby Molekulární (antigenní) mimikry: Genetická konservace klíčových molekul v průběhu evoluce zaručuje, že četné významné molekuly infekčních agens a jejich hostitele jsou si velmi podobné, v určitých doménách dokonce identické. Rozšiřování spektra epitopů v průběhu infekčního procesu Vliv střevní mikrobioty Experimentální modely vč. bezmikrobních zvířat: vliv na zánětlivé choroby střeva, ale i na extraintestinální autoimunitní choroby (revmatoidní arthritida, T1 diabetes, roztroušená skleróza,uveitida). Mikrobiota a nádory Hromadí se důkazy, že fyziologická, komensální mikrobiota má významný vliv na karcinogenezi, progresi nádorů i odpověď na protinádorovou léčbu. Tyto účinky mohou být lokální i celkové. K praktickému využití se nabízí úprava diety, prebiotika, probiotika, transplantace stolice nebo definované mikrobioty. (Dzutsev A et al, Eur J Immunol 2015; 45: 17-31) Mikroby a metabolismus V mikrobiotě střeva obézních je zvýšené zastoupení Firmicutes Souvisí se schopností mikrobioty využívat energii z potravy? Ovlivňují některé bakterie mikrobioty kmenové buňky pro diferenciaci v buňky tukové? Ovlivňuje mikrobiota pocit hladu? Možnosti ovlivnění mikrobioty • Probiotika • Prebiotika • Imunomodulátory • Antibiotika • Terapie bakteriofágy • Transplantace stolice (u infekcí C. difficile) • Produkty mikrobioty (např. bakteriální polysacharidy Bacteroides fragilis) PROBIOTIKA živé mikroorganismy aplikované perorálně, působící blahodárně na zdraví člověka a zvířat nejčastěji používaná probiotika: laktobacily, streptokoky, enterokoky bifidobakterie, E. coli (kmen Nissle), kvasinky (Saccharomyces boulardii) PREBIOTIKA Selektivně fermentované složky potravy, které vedou k specifickým změnám ve složení a aktivitě střevní mikrobioty s blahodárným vlivem na zdraví hostitele: Inulin, fructo-oligosacharidy, galacto-oligosacharidy, lactulosa… Transplantace mikrobioty stolice (fecal microbiota transplantation) • Od jednoho dárce, často blízkého příbuzného. • Od více dárců (stool banks). • Transplantace autologní stolice (odebrané v klidovém období a vhodně uchované). • Anaerobně kultivovaná stolice od zdravých dárců. Využití: průjem vyvolaný antibiotiky průjem způsobený Clostridium difficile perspektivně metabolické, kardiovaskulární, neurologické, autoimunitní, alergické choroby Každý máme svůj vlastní mikrobiální „makeup“ „Náš individuální osud, zdraví a možná i některé z našich činností je mnohem více závislé na variantách genů v našem mikrobiomu než v našich vlastních génech“. Ackerman J: The ultimate social network. (Scientific American 2012) IMUNITA V ÚSTNÍ DUTINĚ Ústní dutina jako součást slizničního imunitního systému Indukční (imunizace , tolerance) i efektorové schopnosti Sliny: obsahují produkty lokální i systémové imunitní reakce slinné žlázy štěrbinová tekutina Etiopatogenéze chorob ústní dutiny je vázána na lokální systémovou imunitu, na lokální i systémové choroby, na vrozenou i adaptivní imunitu, na buněčné i humorální faktory. SLINY • 750 – 1000 mL/den: parotická žláza 40%, submandibulární 40%, sublinguální 10%, malé slinné žlázy 10%. • Většina IgA dimer, 5-10% monomer. IgA1 : IgA2 = 55: 45 • sIgA : IgG : IgM: = 200 : 2 : 1 g/L • Muciny, lysozym, laktoferin, laktoperoxidáza, defensiny a jiné antimikrobiální peptidy, inhibitory proteáz • Sulkulární tekutina (gingival crevicular fluid) se dostává do slin v množství cca 1-2 mL/den, v nichž je naředěna 1:500 – 1:1000. Protilátky zde obsažené jsou především z krve. Imunologicky aktivní buňky v ústní dutině • Epitelové (PRR, cytokiny) • Lymfocyty T, B, diferencované plasmacyty, dendritické buňky, makrofágy, neutrofilní, eosinofilní, basofilní leukocyty, mastocyty, buňky NK • Aplikace antigenu do sliznice indukuje tvorbu protilátek v malých slinných žlázách, aplikace submukózní vede k tvorbě protilátek ve velkých slinných žlázách. • Intranazální a sulinguální imunizace indukuje tvorbu protilátek, které jsou prokazatelné ve slinách i v genitálním traktu. ZUBNÍ KAZ • Je považován za nejrozšířenější (infekční) chorobu • Lokalizovaná destrukce zubní tkáně bakteriemi • Etiologie: především Streptococcus mutans (glucosyl transferase, GTF), surface protein streptococcal antigen I/II (SAI/II) • Možnosti aktivní i pasivní imunizace Vakcíny a vakcinace Aktivní a pasivní imunizace • Aktivní imunizace Indukční fáze – produkční fáze Imunologická paměť (primární a sekundární reakce) Specifická prevence příp. profylaxe a terapie • Pasivní imunizace Účinek okamžitý, přechodný (biologický poločas) Specifická terapie příp. profylaxe Vakcinace je hodnocena medicínsky i ekonomicky jako jeden z nejefektivnějších způsobů prevence vzniku a šíření infekčních chorob. Na individuální úrovni chrání jedince před onemocněním. Na populační úrovni (kolektivní imunita daná vysokou proočkovaností populace) brání šíření infekčních agens a ochrání i neočkované osoby. Jennerova vakcína v Brně (c.k.všeobecný zaopatřovací ústav u sv. Anny) Do roku 1817 proběhlo pět velkých očkovacích slavností s hudbou a zpěvem, tancem, hrami a prémiemi, zprvu na komárovské louce, později v Pisárkách, kde v parku byl postaven dřevěný pavilon ve stylu antické svatyně s bustou E. Jennera. (Kruta V: Počátky očkování proti neštovicím na Moravě, Dějiny vědy a techniky 1971;4: 228-244) On 9th December 1979, the W.H.O. officially declared smallpox to be completely eradicated Pravidelné očkování v ČR 2011 (Vyhláška 537/2006, novela 299/2010 Sb.) povinné plošné očkování proti záškrtu, tetanu, černému kašli, hemofilové invazivní infekci, virové hepatitidě B, dětské obrně, spalničkám, zarděnkám, příušnicím doporučená očkování u rizikových dětí proti tbc (BCG) proti pneumokokovým a meningokokovým (A+C) onemocněním, klíšťové encefalitidě, virové hepatitidě A, planým neštovicím, infekci lidskými papilomaviry, chřipce Hexavakcína Záškrt, tetanus, pertuse, virová hepatitida B, dětská obrna, infekce způsobené H. influenzae b. Ukončení do 18 měsíců věku, přeočkování. Spalničky, zarděnky, příušnice Od 15. měsíce, přeočkování za 6-10 měsíců „Klasické“ vakcíny Atenuované mikroby: BCG (proti TBC), poliomyelitis (Sabinova), spalničky, zarděnky, příušnice, cholera, žlutá zimnice Inaktivované mikroorganismy: pertuse, vzteklina, hepatitis A, klíšťová encefalitida, poliomyelitis (Salkova), cholera Toxoidy: tetanus, záškrt NOVÉ VAKCÍNY Subjednotkové Splitové, štěpené (připravované štěpením infekčních agens a isolací imunoprotektivních složek) Rekombinantní (vložení genu kódujícího protektivní antigen do produkčního mikroorganismu, který pak tento antigen produkuje, vyprodukovaný antigen je izolován a purifikován) Imunogennost je zvýšena adsorpcí na minerální nosič nebo konjugací s bílkovinným nosičem, např. toxoidem. NOVÉ VAKCÍNY Vektorové (vektorem jsou především poxviry, např. vysoce atenuovaný kmen Ankara, ptačí poxviry, adenovirus, S. typhi a další, kromě antigenů mohou kódovat i cytokiny, např. IL-2) DNA-vakcíny (gén, kódující antigen umístěn do bakteriálního plasmidu, který obsahuje imunomodulační nemetylovaný motiv bakteriální DNA – CpG) DNA-vakcíny Úsek DNA kódující příslušný antigen je vpraven s vhodným promotorem do bakteriálního plasmidu. Aplikace intramuskulární, intraepidermální -„gene gun“ slizniční Antigen se vytváří in vivo a indukuje jak protilátkovou, tak celulární imunitní reakci Principy správné vakcinace Individuální přístup k očkovanému. Dodržování absolutních a relativních kontraindikací. Dodržování správné očkovací techniky. Použití vhodné vakcíny podle věku. Vybrání vhodného místa aplikace. Desinfekce místa vpichu (alkohol) Zdravotnický dohled po dobu 30 min. Schema vakcinace Základní schema konvenční, zrychlené Přeočkování Využití fenomenu imunologické paměti (primární a sekundární reakce) Způsoby aplikace vakcín Intramuskulárně jehla 25 mm, oblast nedominantního deltového svalu, u kojenců a batolat do 2 let do střední části anterolaterální oblasti kvadricepsu, kolmo Subkutánně jehla 15-20 mm, kožní řasa nad tricepsem nedominantní paže, pod úhlem 45 st. Intradermálně jehla 9-10 mm, přední strana deltového svalu nebo na volární stranu předloktí Perorálně, sublinguálně, nasálně Nežádoucí účinky vakcinace (Souhrn údajů o přípravku, příbalový leták). Očekávané neočekávané závažné Místní: zarudnutí, otok, bolest Celkové: tělesná teplota (do 37,4 běžné, do 38 tolerováno, od 38,1 léky, lékařská pomoc), únava, bolest hlavy, svalů, kloubů Alergické nežádoucí účinky na aktivní i pasivní složky vakcíny (zpravidla během minut!) Ostatní biologicky významné součásti vakcín Antibiotika (kanamycin, neomycin) Konservační prostředky (thiomersal) Stabilizátory: struktura a konformační integrita epitopů je ovlivněna především teplotou a pH. Chlorid hořečnatý, humánní albumin, laktóza, sorbitol, želatina. Látky z technologického procesu (např. OVA) Imunologické adjuvans Substance podané spolu s antigenem zvyšující jeho imunogennost Glenny AT, Pope CG, Waddington H, Wallace V: The antigenic value of toxoid precipitated by potassium alum (J Path Bacteriol 1926; 38-45, 1926) Aluminium fosfát nebo hydroxid zůstávají stále hlavním imunologickým adjuvans v humánní medicíně Imunologické adjuvans Zesiluje a udržuje imunogennost antigenu. Účinně moduluje imunitní reakci. Redukuje potřebné množství antigenu i nutnost opakovaného podání. Zlepšuje účinnost vakcin u novorozenců, starých osob i nemocných s podlomenou imunitou. Jejich význam je zvlášť důležitý u strukturálně jednoduchých preparátů. Adjuvans: základní mechanismy účinku „Doručení“ antigenu buňkám a orgánům imunitního systému („delivery systems“). minerální soli, emulse, liposomy, virosomy, biodegradovatelné polymerní mikrosféry, ISCOM (immune stimulating complexes) Imunostimulace (především aktivací buněk vrozené imunity) ligandy TLR, cytokiny, saponiny, bakteriální exotoxiny Budoucnost mají komplexní adjuvantní systémy (integrovaná adjuvancia); je nutno vzít v úvahu zvláštnosti patogeneze i rozdílné imunogenní vlastnosti antigenů. Adjuvans aktivuje dendritické buňky Aktivace přímá interakce složek adjuvans charakteru „PAMP“ s TLR i dalšími PRR Aktivace nepřímá prostřednictvím „DAMP“ uvolňovaných při poškození tkání mikroby (kyselina močová, ATP, HMGB-1) Význam „fylogeneticky konservovaných“ struktur mikrobů. Adjuvancia polarizují imunitní reakci Adjuvancia obsahující ligandy TLR (např. monofosforyl lipid A – MPL) podporují odpověď Th1 a CTL, Adjuvancia vedoucí k tvorbě DAMP (např. aluminium a MF59 – emulze squalenu,polyoxyethylen monooleátu a sorbitantrioleátu ve vodě) podporují odpověď Th2 a B. Virosomy, liposomy, ISCOM se uplatňují při zkřížené presentaci a zapojení lymfocytů T CD8+. Adjuvancia v humánních vakcínách Sloučeniny aluminia DPT, DT, H. influenzae b, S. pneumonie, HAV, HBV, inakt. poliovirus, HPV Olej/voda-MF59 HSV, HBV, HIV MPL– AS04/AS02 HAV,HBV, HPV, HIV,malarie, tbc, leishmaniasa Virosomy (IRIV) HBV, HPV/HAV Podjednotka cholerového toxinu B cholera Adjuvans – dvě tváře • Zesiluje, udržuje a směruje imunogennost antigenu. • Účinně moduluje imunitní reakci. • Redukuje potřebné množství antigenu i nutnost opakovaného podání. • Zlepšuje účinnost vakcin u novorozenců, starých osob i nemocných s podlomenou imunitou. • Jejich význam je zvlášť důležitý u molekulárně jednoduchých preparátů. • Má schopnost prolomit přirozenou imunologickou toleranci (experimentální autoimunitní choroby ) Imunoglobulinové preparáty Využití imunoglobulinových preparátů Identifikace a kvantifikace antigenů (mikrobiologie, hematologie, transplantologie, klinická imunologie) Imunoterapie a imunoprofylaxe (klasická pasivní imunizace, terapie nádorů, imunomodulace, především imunosuprese) Izolace a purifikace antigenních preparátů Příprava imunoglobulinových preparátů Polyklonální „antiséra“ (hyperimunní séra) xenogenní (imunizace zvířat – králík, koza, prase, kůň…) alogenní (lidská od přirozeně i záměrně imunizovaných dobrovolníků) Monoklonální protilátky myší modifikované (chimerické, humanizované, lidské) Indikační skupiny imunoglobulinové léčby Substituce tvorby protilátek Primární imunodeficience Sekundární imunodeficience Imunoregulace Autoimunitní choroby Vaskulitidy Alergická onemocnění Léčba infekčních chorob - substituce i imunoregulace Antiséra používaná v lidské medicíně • Antibakteriální: tetanus (lidské), botulismus (koňské), antigangrenózní (koňské), záškrt (koňské) • Protivirová: hepatitida B (lidské), vzteklina (koňské), varicella-zoster (lidské), CMV (lidské), klíšťová encefalitida (lidské), hepatitida A, spalničky a jiné virózy (nespecifický lidský imunoglobulin) • Proti hadím a pavoučím jedům (koňská) • Anti Rh (lidské) Nespecifické (normální) imunoglobulinové deriváty (příprava z plasmy 15 000-60 000 zdravých dárců krve) Intravenózní - 5%: 7S - intaktní molekula IgG 5S - molekula IgG rozštěpena v pantové oblasti na fragmenty Fab2 a Fc (Gama-Venin) IgM, obohacené preparáty (Pentaglobin) Intramuskulární 16% roztok převážně IgG Subkutánní - jedná se v podstatě o intravenózní deriváty zahuštěné na 16%. Indikace substituční imunoglobulinové léčby IgG > 5 g/l: Při klinicky zřejmé imunodeficienci a poruše tvorby specifických protilátek. 5 g/l< IgG> 2 g/l: Při příznacích imunodeficience nebo poruše tvorby specifických protilátek. IgG < 2 g/l: Jednoznačná indikace zahájení imunoglobulinové léčby.