IMUNOLOGIE V ZUBNÍM LÉKAŘSTVÍ 7 (2018) Imunologické aspekty transfúze krve. Imunologické aspekty transplantací. Vyšetřovací laboratorní imunologické metody. Prof. J. Lokaj Transplantační imunologie „Transplantace“ (sv. Kosmas a Damián), 3. století n.l. Transplantace orgánů, tkání, buněk Dárce a příjemce: • Autogenní transplantace(autograft) • Isogenní transplantace (isograft) • Alogenní transplantace (allograft) • Xenogenní transplantace (xenograft) Význam MHC: Rejekce (odvržení, odhojení) štěpu Reakce štěpu proti hostiteli (graft vs.host reaction) Transplantace orgánů, tkání, buněk Dárce a příjemce: • Autologní transplantace (autograft) • Syngenní transplantace (isograft) • Alogenní transplantace (allograft) • Xenogenní transplantace (xenograft) Důsledky histoinkompatibility: • Rejekce (odvržení, odhojení) štěpu • Reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host reaction – GvHR) Major histocompatibility complex (MHC) Human leukocyte antigens (HLA) Charakteristika genů MHC • Dvě třídy: MHC I a MHC II (HLA I, HLA II) (krátké raménko 6. chromosomu) • Polymorfismus: Geny MHC jsou nejpolymorfnějšími geny v genomu • Kodominantní exprese: Každý jedinec má dvě alely (od obou rodičů); označují se číslicemi (např. HLA-A2, HLA-B5, HLA-DR3 …) • Soubor MHC alel na chromosomu se nazývá haplotyp Charakteristika molekul (antigenů) MHC • Molekuly MHC I třídy jsou přítomny na všech jaderných buňkách(tedy ne na erytrocytech!) • Molekuly MHC II třídy jsou přítomny na buňkách imunitního systému (buňky předkládající antigen – dendritické buňky, makrofágy, B-lymfocyty), dále na buňkách endotelových a na epitelu thymu. • Exprese molekul MHC I je na většině buněk zvýšena působením IFN, TNF, LT (tedy při vrozených imunitních reakcích) • Expresi molekul MHC II na buňkách presentujících antigen, vaskulárních endotelových buňkách, ale i na jiných buňkách (ne však na neuronech) zvyšuje IFNg Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Nomeklatura HLA systému (WHO) Sérologická (HLA antigeny): Např.: HLA-A2 HLA-DR3 HLA-B27 Molekulárně genetická (DNA) nomenklatura (HLA alely) Např.: HLA-A*0201 HLA-A*02 alelická skupina HLA-A*0201 alela 2010 Numbers of HLA Alleles HLA Class I Alleles 3,411 HLA Class II Alleles 1,222 HLA Alleles 4,633 Other non-HLA Alleles 110 Molekula MHC I. třídy (HLA-A, HLA-B, HLA-C) Molekula MHC II. třídy (HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ) Charakteristika interakcí mezi MHC a peptidy • MHC molekuly neodlišují peptidy vlastní a cizí • MHC molekuly váží řadu strukturálně podobných peptidů (x TCR-epitop) • Vazba je nekovalentní, ligand pro MHC I sestává z 8-11 aminokyselin, pro MHC II cca z 10-30 Presentace antigenů lymfocytům T • T-lymfocyty poznávají antigeny pouze ve formě peptidových fragmentů vázaných na MHC I nebo II. (Fenomen MHC-restrikce). • Antigen musí být nejdříve v buňkách „zpracován“ (processing)- nativní protein je proteolyticky degradován na peptidy, které se (intracelulárně) váží na molekuly MHC. Tento komplex se dostává na buněčnou membránu, kde je schopen reagovat s TCR. • T-lymfocyty jsou schopny poznávat i lipidové a glykolipidové struktury: je to populace NKT, která poznává tyto antigeny „neklasickými molekulami MHC“ – CD1 • Imunogennost proteinových antigenů je určena schopností buněk předkládajích antigen vytvořit peptidy, které se budou vázat na vlastní molekuly MHC. Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier ALLORECOGNITION • Direct allorecognition (response of the recipient´s T-cells to the graft is really due to cross-reactivity in which peptide/alloMHC complexes look like nonself peptides presented on self MHC) • Indirect allorecognition (recipient CD4+ T cells are stimulated by recipient APC that have acquired peptides derived from proteins, predominantly MHC molecules, of the donor) Využití HLA typizace • transplantace • PBSCT – vysoké rozlišení • ledviny – nízké rozlišení • asociace HLA s určitými chorobami • ankylozující spondylitida • celiakie Vyšetření HLA systému HLA typizace - stanovení HLA výbavy (antigenů, alel) konkrétního jedince DNA (HLA gen) mRNA protein (HLA antigen) Mol. genetické techniky Sérologické techniky SÉROLOGICKÉ versus DNA TECHNIKY Sérologie (mikrolymfocytotoxický test): typizace HLA I. třídy (rozlišení př. HLA-A2) crossmatch screening anti-HLA protilátek relativně rychlá a levná DNA techniky: typizace HLA I. a II. třídy (nízké i vysoké rozlišení ) vyšší přesnost a spolehlivost typizace lze i statim vyšetření vyšší náklady HLA typizace - DNA techniky Nejčastěji používané techniky: PCR-SSP (Polymerase chain reaction with sequence specific primers) PCR-SSO (Polymerase chain reaction with sequence specific oligoprobes) SBT (Sequence based typing) HLA při transplantacích buněk a orgánů • Význam „HLA typizace“ • Imunologické příčiny rejekce transplantátů • Imunologická reakce štěpu proti hostiteli (GvHR) • Imunosuprese a transplantace Vliv HLA-identičnosti dárce a příjemce na přežití ledvinného štěpu Transplantace – vyšetření příjemce štěpu • Určení krevní skupiny AB0 (transplantace orgánů) • Typizace HLA I (A, B, C) • Typizace HLA II (DR,DQ) • Přítomnost autoprotilátek • Preformované aloprotilátky (panel reactive antibody) • „Crossmatching“ – přítomnost preformovaných protilátek specifických pro potenciálního donora • Kultivace směsi lymfocytů (mixed lymphocyte culture assay) – shoda v oblasti D. Transplantace – rejekce štěpu • Rejekce hyperakutní - během minut- (protilátky proti AB0 nebo HLA antigenům) • Rejekce akutní – po prvním týdnu - (je způsobena efektorovými lymfocyty T příjemce, odpovídajícími na HLA dárce, a protilátkami). • Rejekce chronická – asi po půl roce- (reakce pozdní přecitlivělosti, vedoucí k fibrose, poškození cév a ztrátě funkce štěpu). Imunosupresivní léčba Transplantace hemopoetických kmenových buněk Zdroj: kostní dřeň (odběr z lopaty kosti kyčelní) periferní krev (dárce „stimulován“ růstovými faktory k zvýšení tvorby kmenových buněk) pupečníková krev (zdroj nezralých kmenových buněk omezené imunogennosti) Typy transplantace: autologní alogenní Reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host reaction, GvHR) Důsledek imunologické reakce T-lymfocytů donora na tkáně pacienta • Makulopapulární exantém, generalizovaná erytrodermie , puchýře, deskvamace • Zvýšení koncentrace bilirubinu v séru • Průjem, velké bolesti břicha, ileus • Orální manifestace Chronická reakce štěpu proti hostiteli (GvHR) orální manifestace Ústní dutina bývá postižena u 45% - 83% pacientů s GvHR: mukokéla atrofie, periorální fibróza postižení temporomandibulárního kloubu otok sliznice ulcerace lichenoidní léze slizniční erytém pocit suchosti v ústech, bolest, zvýšená citlivost Imunologická reakce na zubní implantáty • Prevalence „periimplantatidy“ v souvislosti s titanovými implantáty se odhaduje cca u 20% pacientů. • Uvádí se úloha titanium oxidu jako faktoru, podílejícího se na biologických komplikacích. • K vyšetřování reakce hostitele v parodentálních tkáních se využívá analýzy sulkulární tekutiny, především cytokinů ; především jde o IL-1 beta a TNF alfa, jejichž koncentrace je zvýšena. • Podobná exprese vybraných biomarkerů implantátů titanu, zirkonia a zdravých zubů patrně odráží individuální zánětlivou reaktivitu pacientů, která není lokálně modifikována implantátem. (Cionca N et al.: Pro-inflammatory cytokines at zirkonia implants and teeth, A cross.sectional assesment. Clin Oral Invest 2016; 20: 2285 – 2291) Imunosupresivní léčba • Indikována především u autoimunitních chorob, vaskulitid, a u pacientů po transplantacích. • Vyjímečně používána u těžkých alergických chorob nebo u onemocnění způsobených nadměrnou aktivací T-lymfocytů (psoriáza). • Léčba vždy vede k sekundární imunodeficienci náchylnosti k infekcím, častější výskyt malignit, zejména lymfatického systému. • Ke snížení výskytu vedlejších reakcí se obvykle používá kombinovaná léčba. Antiproliferativní imunosupresiva • Antagonisté kyseliny listové - metotrexát (Methotrexat) • Alkylační látky - cyklofosfamid (Cyclophophamide), chlorambucil (Leukeran) • Purinové analogy- azathioprin (Azamun, Imuran) • Inhibitory inosinmonofosfát dehydrogenázy mykofenolát mofetil (Cellsept) Imunusupresiva zasahující do metabolismu IL-2 • Kalcineurinové inhibitory: Blokují funkci Ca 2+-dependentního kalcineurinu, tím blokují aktivaci NFAT. Nedojde k derepresi genu pro IL-2. • Cyklosporin A- vazba na cyklofilin • Tacrolimus (FK 506) vazba na FKBP • Sirolimus (Rapamycin) - blokuje přenos signálu z IL-2, též se váže na FKBP. NFAT: Nuclear Factor of Activated T cells FKBT: FK- Binding Protein Cyklosporin-A (Consupren, Sandimun) • Snižuje produkci IL-2 i odpověď T- lymfocytů na tento cytokin. • Ovlivněny především Th lymfocyty. • Nežádoucí účinky: nefrotoxicita, hirsutismus, hypertrofie gingiv, neurotoxicita. • Používán v transplantologii a u závažných autoimunitních chorob. Glukokortikoidy jako imunosupresiva • Imunosupresivně působí především dávky 0,5-1 mg Prednisonu/kg/den, udržovací dávka bývá u dospělých 5-10 mg Prednisonu/den. • Mechanismy účinky: • Snížená produkce cytokinů (IL-1, TNF-a, IL-2) • Snížení exprese adhezivních molekul • Inhibice exprese HLA-II • Inhibice fosfolipázy A2 v granulocytech - blok tvorby metabolitů kyseliny arachidonové. • Vedlejší činky: redistribuce tuku, vznik vředové choroby, steroidní diabetes, hypertenze, poruchy růstu dětí, hypokalémie, osteoporóza, katarakta, psychózy.... Terapeutické využití monoklonálních protilátek • Imunosupresivní léčba: • Anti-CD3 (Ortoclone OKT3) • Anti-CD25: daclizumab (Zenapax), basiliximab (Simulect) • Protizánětlivá léčba • Anti TNFa: infliximab (Remicade) • Protinádorová léčba: • Anti-CD20: rituximab (Mabthera) + kombinace s 90Y nebo 131I • Anti-CD52 altuzumanb (Campath) • Anti-epidermal growth factor-R: trastuzumab (Herceptin) • Anti-CD33 konjugovaná s ozogamycinem (Mylotarg) • …… Imunosupresiva registrovaná v České republice 2018 mechanismus účinku • Glukokortikoidy: ovlivnění exprese genů • Cyklofosfamid, azathioprin, mykofenolát: ovlivnění metabolismu DNA • Cyklosporin, takrolimus, sirolimus: vazba na imunofiliny • Monoklonální protilátky: rituximab (proti CD20 lymfocytů B), infliximat, adalimumab (proti TNF alfa), anakinra (proti IL-1), brodalumab (ptoti IL-17),natalizumab (proti alfa4 integrinu), ekulizumab (proti C5 složce komplementu) ….. • Imunoglobuliny (iv, sc) : ovlivnění buněk imunitního systému IMUNOLOGICKÉ ASPEKTY TRANSFUZE KRVE Karl Landsteiner (1868 – 1943) Nobelova cena 1930 The specificity of serological reactions (Harvard University Press, 1945) Biochemical specificity peculiar to a species. Blood groups AB0; M and N types; Rh-factor H A P T E N Polysacharidové antigeny krevních skupin • Nejdůležitější je systém ABO. • Antigeny mohou být přítomny i v sekretech a na mnoha epiteliálních a endoteliálních buňkách. • „Základní strukturou“ ABO antigenů je substance H. Velmi řídce se vyskytuje „bombajský fenotyp“ tj nepřítomnost H-substance. • Protilátky jsou IgM isotypu, vyskytují se přirozeně. • Mezi malé krevní skupiny patří systémy MN a Ss Transfuse krve Systém krevních skupin „AB0“ 0: ceramid-Glu-Gal-GalNAc-Gal l Fuc A: ceramid-Glu-Gal-GalNAc-Gal-GalNAc l Fuc B: ceramid-Glu-Gal-GalNAc-Gal-Gal l Fuc Přirozené isohemaglutininy Krevní skupina A: isohemaglutininy anti-B Krevní skupina B: isohemaglutininy anti-A, Krevní skupina 0: isohemaglutininy anti-A, anti-B Krevní skupina AB: isohemaglutininy anti-A ani anti-B nejsou přítomny Bílkovinné antigeny krevních skupin • Nejdůležitější je systém Rh. • Protilátky jsou IgG isotypu, objevují se pouze po antigenním stimulu. • Mezi malé krevní skupiny patří systémy Kelly, Lewis, Duffy. Další příklady krevních skupin – antigeny a protilátky Rh (D, C/c, E/e) Krevní skupina protein Antigen Alogenní protilátky Klinická relevance IgG HTR, HDN Lewis (Lea, Leb) oligosacharid protein protein protein protein IgM/IgG IgG IgG vzácně HTR HTR, HDNKell (K/k) Duffy (Fya, Fyb) Kidd (Jka, Jkb) I/i MNSsU sacharid - IgG IgM IgM/IgG HTR, HDN Anti-M: vzácně HDN Anti-S, -s, -U: HTR, HDN HTR (opožděně) HDN (slabší) Transfuze krve - komplikace Po převodu krve neslučitelné v systému AB0 dochází k hemolytické reakci, která je způsobena intravaskulární destrukcí červených krvinek protilátkami příjemce: Bolesti na hrudi, v zádech, dušnost, neklid, horečka s třesavkou, zvracení, hypotenze, šokový stav. Přežije-li nemocný šokový stav, objeví se do 24 hod. žloutenka, selhání ledvin, krvácení z diseminované intravaskulární koagulace, trombocytopenie a fibrinolýzy. Transfuze krve - komplikace • Reakce vyvolané protilátkami proti leukocytům a trombocytům (asi u 1/3 nemocných s těmito protilátkami po opakovaných transfuzích – do 3 hod. po převodu horečka, třesavka, zimnice, bolesti hlavy, zrudnutí, tlak na hrudi, kašel) • Alergické reakce (kopřivka, larygospasmus, anafylaktoidní reakce – IgA-anti IgA) • Aloimunizace • Reakce s přetížení oběhu (u zdravého lze převést 1L/za 2-3 hod., přetížení vede k akutnímu srdečnímu selhání) • Vzduchová embolie (při přetlakové transfusi) Potransfuzní reakce - shrnutí • Hemolytické : bolesti svalstva, hlavy, nausea, vzestup teploty. Stav může vyústit do šoku a/nebo ledvinného selhání. Obvykle se objevuje rychle, během vlastní transfúze, existují i pozdní formy. • Febrilní - často dána protilátkami proti vedlejším krevním skupinám. • Alergické: kopřivka, může se rozvinout bronchospasmus, někdy až anafylaktický šok. • TRALI syndrom: (transfusion-related acute lung injury) dušnost, kašel časně po transfúzi. Příčinou jsou agregáty trombocytů v plicích. Transplacentární přenos faktorů imunity imunoglobuliny (IgG) (úloha FcRn) buňky v 3. trimestru se dostává z plodu do mateřského oběhu cca 200 000 buněk denně - zejména buňky trofoblastu do oběhu plodu pronikají transplacentárně mateřské lymfocyty – („mikrochimerismus“) Hladiny imunoglobulinů v séru před a po narození Inkompatibilita v Rh systému mezi matkou a plodem Protilátky proti Rh = IgG Transplacentární přenos Hemolytický účinek (+ C-systém, fagocyty) Coombsův antiglobulinový test (přímý, nepřímý) Cave: Mater certa, pater semper incertus! Profylaxe: anti Rh sérum po porodu