Téma PZ03: Dg. některých dalších grampozitivních baktérií (enterokoků, listerií, korynebakterií, bacilů) K nastudování: Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium (ze skript, učebnic, internetu). Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace Tabulka pro hlavní výsledky úkolů číslo 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Úkol 2 Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné Katalázový test Úkol 3a Slanetz-Bartley Úkol 3b Žluč-eskulinová půda Úkol 3c Arabinózový test Úkol 4a MALDI TOF Úkol 4b Růst v ledničce Úkol 5a DEFINITIVNÍ ZÁVĚR* *U bacilů a listerií napište pouze rodové jméno. Druhové určení by vyžadovalo přesnější testy, které nemohou být v praktiku provedeny. Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte písmeny popsané kmeny. Obarvěte je podle Grama a výsledky zaneste do tabulky. Nezapomeňte na důležité detaily („tyčinky v palisádách“, „robustní, sporulující tyčinky“ a podobně). Aby nedošlo k záměně, popište sklíčka dermografem. Další úkoly budeme provádět pouze s grampozitivními bakteriemi. Úkol 2: Morfologie kolonií G+ koků a tyčinek Popište kolonie jako obvykle. V popisu vynechejte gramnegativní bakterie, ale prohlédněte si je pro srovnání. U kmenů, které jste identifikovali jako G+ tyčinky, se pokuste uhádnout, o jakou bakterii by mohlo jít, podle následující charakteristiky: Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie, „rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou hemolýzou, jindy zcela bez ní. Mikroskopicky velmi robustní tyčinky, někdy s nálezem centrálně až subterminálně uložených endospór, jež mohou, ale nemusí bubřit tyčinku. Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s hemolýzou, mikroskopicky drobnější než Bacillus, neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých řetízcích. Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o hodně menší, většinou bez hemolýzy; v mikroskopii spíše menší než předchozí, ale kyjovité a uspořádané do palisád. Úkol 3: Některé běžné biochemické a kultivační testy a) Katalázový test Proveďte katalázový test pro všechny kmeny, které jsou G+. Poznámka: Testování katalázy u G+ tyčinek se může zdát zbytečné, protože Listeria, Corynebacterium i Bacillus jsou v testu pozitivní. Ovšem některé jiné koryneformní tyčinky (např. Arcanobacterium) jsou negativní, a proto má kataláza v diagnostice G+ tyčinek své místo. b) Růst na Slanetz-Bartleyho půdě Na misce máte naočkované tytéž kmeny jako v úkolu 1. Pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale navíc mají typickou růžovou až červenohnědou barvu. Na této půdě rostou pouze enterokoky. Výsledek zapište do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinové půdě Na rozdíl od předchozí umožňuje žluč-eskulinová půda nejen růst rodu Enterococcus (to umožňuje rozlišit jej mezi G+ koky), ale také Listeria (diagnostická mezi G+ tyčinkami). V pozitivním případě vidíte černé kolonie. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 4: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus faecalis). b) MALDI-TOF pro přesnější diagnostiku enterokoků a koryneformních tyčinek Ačkoli arabinózový test lze považovat za dostatečný pro běžné případy, v některých situacích potřebujeme diagnostiku založenou na více znacích a schopnost detekovat více než dva druhy enterokoků. Podobně termín "koryneformní tyčinky" obvykle představuje dostatečnou úroveň určení korynebakterií a příbuzných bakterií (zejména pokud jsou izolovány z kůže), ale ne pro důležité izoláty (například z krevního oběhu). Jak pro enterokoky, tak i pro koryneformní tyče je možné použít některé biochemické testy. Test na Enterococcus je vyráběn i v Česku ("EN-COCCUStest firmy Erba Lachema"), ale neexistuje žádný test Lachema pro koryneformní tyčinky, takže by bylo zapotřebí použít jiné testy (například API® Coryne od firmy Bio-Mérieux). V poslední době je také možné oba nahradit metodou MALDI-TOF. Odečtěte výsledky MALDI-TOF u tří z vašich kmenů (dva enterokoky a jedna koryneformní tyčinka). Napište výsledky do tabulky a odpovězte na následující otázku: Do jaké úrovně jsou kmeny určeny pomocí MALDI-TOF? Podtrhněte, co platí: První enterokok, tzn. kmen ___ (napište písmeno) je určen na úroveň (podtrhněte nebo zakroužkujte): jisté určení druhu – pravděpodobné určení druhu – jisté určení rodu – neurčeno Druhý enterokok, tzn. kmen ___ (napište písmeno) je určen na úroveň (podtrhněte nebo zakroužkujte): jisté určení druhu – pravděpodobné určení druhu – jisté určení rodu – neurčeno Koryneformní tyčinka, tzn. kmen ___ (napište písmeno) je určena na úroveň (podtrhněte nebo zakroužkujte): jisté určení druhu – pravděpodobné určení druhu – jisté určení rodu – neurčeno Úkol 5: Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Úkol 6: Vztah enterokoků a G+ tyčinek k antibiotikům Úkol 6a: Testy citlivosti enterokoků a grampozitivních tyčinek na antibiotika Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako Enterococcus faecalis a Listeria sp. Test na Enterococcus faecium chybí, protože tato bakterie je často izolována ze stolice, kde testy citlivosti nejsou nutné. Nicméně nacházíme i kmeny z moče – viz úkol 6b. Nenaleznete ani test na Corynebacterium sp., mlčky předpokládáme, že náš kmen je původem z kůže a můžeme jej tedy považovat na součást normální mikroflóry. Také test na Bacillus sp. byste hledali marně – ve většině případů jsou bacily považovány za kontaminaci z prostředí a tudíž nebývají testovány. Interpretujte kmeny jako citlivé (C), intermediární (I) či rezistentní (R) k daným antibiotikům. Kmen Antibiotikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Ampicilin AMP ≥ 10 mm 8–9 mm < 8 mm Nitrofurantoin F ≥ 15 mm < 15 mm Vankomycin VA ≥ 12 mm < 12 mm Tetracyklin* TE ≥ 19 mm 15–18 mm < 15 mm Q. + D.** QD ≥ 22 mm 20–22 mm < 20 mm Gentamicin CN*** ≥ 8 mm < 8 mm *výsledek testu platí i pro doxycyklin **quinupristin + dalfopristin, kombinace dvou streptograminových antibiotik ***k léčbě enterokokových infekcí se hodí pouze v kombinaci s betalaktamy Úkol 6b: Demonstrace testu citlivosti u kmene Enterococcus faecium Na bočním stole můžete vidět test na E. faecium. Napište název antibiotika, které je lékem volby u infekcí způsobených E. faecalis, avšak z důvodu primární rezistence jej nelze použít u E. faecium: _________________ Úkol 6c: Demonstrace kmene VRE Na bočním stole nebo v prezentaci máte také kmen VRE. S použitím své paměti a/nebo jarních protokolů, napište, co znamená zkratka VRE: ____________________________________________ Úkol 7: Demonstrace Elekova testu Principem Elekova testu je precipitace mezi toxinem z toxického kmene a antitoxinem z papírového proužku, napuštěného antisérem. Jak toxin, tak i antitoxin difundují agarem. Studenti zubního lékařství tento úkol neprovádějí, mohou si však prohlédnout obrázek v prezentaci.