Klinická imunologie - cvičení Ústav klinické imunologie a alergologie
2018 FN u sv. Anny v Brně a LF MU
- 1 Burst
test
(test oxidačního vzplanutí)
Teorie
Test je využíván ke kvantitativnímu vyhodnocení oxidačního (respiračního) vzplanutí
fagocytů (především granulocytů). Pro vyšetření se používá plná nesrážlivá krev odebraná do
zkumavek s heparinem.
Fagocytující buňky se stimulují pomocí bakterií E. coli, fMLP (N-formyl-Methionyl-LeucylPhenylalanin)
a PMA (phorbol-myristát-acetát). Dochází k oxidačnímu vzplanutí, při kterém se tvoří
reaktivní kyslíkové sloučeniny a radikály, které oxidují dihydrorhodamin (DHR) na rhodamin.
Fluorogenní substrát DHR, který se na začátku přidá k buňkám, prochází membránou a sám o sobě
není fluorescenčně aktivní. Fluoreskuje až produkt (rhodamin), který vzniká z DHR při oxidačním
vzplanutí. Procento granulocytů, ve kterých došlo k oxidačnímu vzplanutí měříme na průtokovém
cytometru. Máme celkem 4 zkumavky: neg. kontrola - bez stimulátoru, zjistí se podle ní fluorescence
pozadí u daného pacienta, 3 zkumavky se stimulátory (E. coli, fMLP, PMA).
Materiál a pomůcky
Plná krev v heparinu, PBS, dihydrorhodamin 123 (DHR123), E. coli, fMLP, PMA, zkumavky 5 ml,
mikrozkumavky 1,5 ml ("eppendorfky"), vortex, pipety, špičky, ledová lázeň, vodní lázeň 37°C,
lyzátor, cytometr.
Postup
1. Plnou krev v heparinu rozpipetovat po 100 µl do 4 zkumavek.
2. Všechny zkumavky dát na 5 min do ledové lázně.
3. Naředit roztok PMA: k 16 µl rozmraženého PMA přidat 270 µl PBS.
Naředit roztok fMLP: k 40 µl rozmraženého fMLP přidat 40 µl PBS.
4. K vychlazené krvi ve čtyřech zkumavkách pipetovat:
a. zk.č.1 – 20 µl PBS
b. zk.č.2 – 20 µl rozmraženého alikvotu E.Coli
c. zk.č.3 – 20 µl naředěného fMLP
d. zk.č.4 – 20 µl naředěného PMA
5. Promíchat.
6. Všechny zkumavky inkubovat 10min ve vodní lázni při 37°C.
7. Naředit DHR – Nechat rozmrznout zkumavku s 45µl DHR, přidat 450µl PBS pro BT,
důkladně promíchat na Vortexu.
8. Dát vychladit PBS tak, aby byl ledový, ale ne zmrzlý.
9. Po ukončení inkubace přidat ke všem zkumavkám 30µl naředěného DHR. Důkladně
promíchat na Vortexu. Nechat inkubovat 10min ve vodní lázni při 37°C.
10. Přidat ke každé zkumavce 2ml ledového PBS pro BT. Centrifugovat 2000ot/5min.
11. Slít supernatant, sediment rozmíchat na Vortexu a lyzovat na lyzátoru.
12. Pasteurovou pipetou stáhnout pěnu.
13. Do odečtení uchovávat v ledničce.
14. Odečíst na průtokovém cytometru.
Vyhodnocení
Normální hodnoty při stimulaci - E. Coli >70%
- PMA >90%