Imunoanalýza ELISA Mgr. Julie Štíchová Fakultní nemocnice u Sv. Anny v Brně Ústav klinické imunologie a alergologie Imunoanalytické metody Rozdělení metod dle typu značky: oEIA – značkou je enzym oRIA - radioizotop oLIA - luminofor oFIA - fluorofor Rozdělení metod dle uspořádání: oHomogenní oHeterogenní oKompetitivní oNekompetitivní Vizualizace reakce antigen-protilátka pomocí značky Imunoanalytické metody Heterogenní kompetitivní: oAnalyt ze vzorku + značený analyt od výrobce – soutěž o omezené množství antigenu oMěřený signál je nepřímo úměrný množství analytu Heterogenní nekompetitivní: oDetekční protilátka / antigen v nadbytku –analyt ze vzorku vyvázán oMěřený signál je přímo úměrný množství analytu ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay oHeterogenní imunoanalýza – nutná separace nezreagovaných složek oVazba antigenu / protilátky na pevnou fázi (stěna destičky) oVizualizace - enzymatická přeměna substrátu na barevný produkt oKřenová peroxidáza (tetrametylbenzidin → tetrametylbenzimidin → 450 nm) oAlkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát → nitrofenol → 405 nm) oVysoká citlivost – pg/ml ELISA - uspořádání Nepřímá ELISA oNa analyt se váže primární neznačená protilátka oNa primární protilátku se váže sekundární značená protilátka Přímá ELISA oAnalyt (Ab/Ag) imobilizován oDetekce pomocí značené protilátky ELISA - uspořádání Kompetitivní ELISA oDetekce analytů s malou Mr Sendvičová ELISA oDetekce analytů s vysokou Mr (proteiny) oVysoká přesnost http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html Sendvičová ELISA –vyšší senzitivita oSystém biotin – avidin/streptavidin – na jeden imunokomplex se váže více molekul enzymu – silnější zbarvení (pro analyty s nízkou koncentrací) Kautování ELISA desky oImobilizace Ag nebo Ab na plastový povrch desky 1. Povrchová aktivace desky ◦ vazba NH2 nebo COOH skupin – tvorba kovalentních vazeb s protilátkou nebo antigenem ◦ Vhodné pro stanovení malých molekul – např. peptidy 2. Pasivní adsorpce ◦ Hydrofóbní interakce mezi nepolárními strukturami proteinu a plastovým povrchem desky ◦ Protein určený k adsorpci je rozpuštěn v alkalickém kautovacím pufru (pH 9,5) – naleptává plastový povrch a usnadňuje adsorpci Ag nebo Ab o Blokování desky o Po navázání Ab/Ag zůstává část plastového povrchu volná. Aby bylo zabráněno nespecifickým vazbám, je nutno tato místa zablokovat inertní bílkovinou BSA – bovinní sérový albumin Systém záchytná + detekční Ab Proč je každá protilátka od jiného živočišného druhu? Záchytná protilátka myší, polyklonální Detekční protilátka humánní, monoklonální Lidská monoklonální protilátka – s vysokou specifitou váže pouze konkrétní antigen Záchytná protilátka – s vysokou senzitivitou váže všechny varianty daného antigenu Tato kombinace významně snižuje riziko zkřížené reaktivity, která by mohla způsobit vznik nespecifických imunokomplexů (zdroj falešné pozitivity)!!! Měření výsledků oPřístroj ELISA reader oPrincip – vertikální spektrofotometrie oZdroj světla – Xe výbojka oVýběr vlnové délky – interferenční filtry oOptická dráha – 9 optických vláken (8 měří vzorky, 9. vlákno kontrola intenzity záření) o9 detektorů - fotodiody Výsledky 1. Kvalitativní ◦ Hodnotíme vizuálně přítomnost / nepřítomnost reakce → ano / ne (např. srovnání vzorku s blankem) 2. Semi-kvantitativní ◦ IP (index pozitivity) = absorbance vzorku / absorbance cut-off kalibrátoru 3. Kvantitativní ◦ Kalibrační křivka – ředění kalibrátoru o známé koncentraci analytu ◦ Výsledek (absorbance = OD, optická denzita) se odečítá z kalibrační křivky ◦ Přepočet absorbance na koncentraci (Lambert-Beerův zákon) ◦ Výsledek má číselnou hodnotu s udanými jednotkami (např. U/ml, ug/ml) Využití ELISA v imunologii oAntiinfekční imunita oStanovení protilátek proti některým infekčním agens oAutoimunitní onemocnění oStanovení autoprotilátek ELISA a antiinfekční imunita oProtilátky proti tetanickému toxoidu oProtilátky proti difterickému anatoxinu oProtilátky proti kapsul. antigenu Haemophilus Influenzae oProtilátky proti specifickému pneumokokovému kapsulárnímu polysacharidu (anti-PCP) Sledování odpovědi na vakcinaci, sledování stavu imunitního systému (zájem především o snížené hladiny – imunodeficience) Autoimunitní onemocnění oCelá škála autoprotilátek (orgánově nespecifické, orgánově specifické) oANA – proti jaderným antigenům (SLE) oENA – proti extrahovatelným nukleárním antigenům (SS-A, SS-B, Jo1 atd. – Sjogrenův sy.) oAMA – proti mitochondriím (primární biliární cirhóza) oASMA, LKM, LC – autoimunitní hepatitidy oANCA – proti cytoplazmě neutrofilů oAnti-TTG –tkáňová transglutamináza (celiakie) oAnti-TG-tyreoglobulin, anti-TPO-tyreoidální peroxidáza (tyreoitidy) oRF – revmatoidní artritida oEMA –proti endomysiu – celiakie oASCA – proti Sacharomyces cerevisiae – Crohnova choroba Hodnocení výsledků - kvantitativní Kalibrační řada Blank Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky pacientů Hodnocení výsledků oV klinické laboratoři existuje určitá hierarchie hodnocení výsledků oPodílí se na něm laborant i VŠ oVždy se hodnotí zároveň papírový výsledek s ELISA deskou 1. fáze kontroly – zdravotní laborant o Vizuální kontrola desky –zbarvení o Vizuálně hodnotí, zda se naměřená absorbance (barva jamek) shoduje s výsledky na papíře (pozitivní pacienti – shodují se souřadnice jamek na desce se souřadnicemi v tištěných výsledcích?) ◦ ANO – kontrola pokračuje do další fáze ◦ NE – hledáme příčinu (záměna desky) Hodnocení výsledků 2. fáze kontroly – VŠ pracovník oVizuální kontrola desky o Není zbarvení moc tmavé nebo světlé? o Není v jamkách sraženina / nečistota? oHodnocení s tištěnými výsledky – kontrola kalibrace: o Kontrola průběhu kalibrační křivky o Kontrola jednotlivých bodů – není některý výrazně mimo? o Pozitivní kontrola – leží v rozmezí, které udává výrobce? o Pozitivní vzorek pacienta – souhlasí poloha na desce s papírovým výsledkem? Hodnocení výsledků oPokud nevyšly kontroly, musí se hledat příčina: o Máme tu správnou desku? Na jakém programu byla změřena? Jaká je šarže kontrol (mohlo nedávno dojít ke změně) oPokud pozitivní kontrola vyšla příliš vysoká/nízká: o Všímáme si rozsahu kalibrace – měla by být co nejširší – od velmi nízkých hodnot absorbance až po vysokou o Zjišťujeme, jak vypadala předchozí měřená kalibrace o Kontrola pozitivních pacientů se záznamy v LISu (pokud již pacient byl dříve vyšetřen a aktuálně změřený výsledek se shoduje s jeho historií, je pravděpodobně špatně pouze kontrola): o Možná chyba ředění laborantky o Kontrola lahvičky – set, šarže Hodnocení výsledků oVýsledky měření kontrol se dlouhodobě zaznamenávají v čase – interní kontrola kvality o Levey-Jenningsův diagram → Westgardova pravidla o Varovné a regulační meze Stoupající nebo klesající trend může značit expiraci setu Hodnocení výsledků oPokud nevyjde kalibrace a kontroly – nutno vyšetření opakovat oPokud je vše v pořádku – VŠ výsledek ELISY podepíše (přebírá za ně odpovědnost) 3. Fáze kontroly o Přepis výsledků ELISA do pracovního listu o Přepisování výsledků z pracovního listu do systému (POZOR na překlepy) 4. Fáze kontroly - VŠ o Ve chvíli, kdy má pacient všechna požadovaná vyšetření hotová, provádí se validace výsledků o VŠ v počítači kontroluje, zda výsledky dávají smysl o Seznam výsledků, které je nutno okamžitě hlásit lékaři – VŠ mu vysvětluje, co to znamená o Uvolnění výsledků Hodnocení výsledků 5. Fáze kontroly – VŠ oZvalidované a uvolněné výsledky pacienta se tisknou v papírové podobě oExpedice výsledků – VŠ, který výsledky uvolnil opět kontroluje tyto výsledky pacienta v papírové podobě → o Není ve výsledcích něco podezřelého? o Nezapomnělo se na žádné vyšetření? oTištěné výsledky opouštějí pracoviště a putují k ošetřujícímu lékaři Hodnocení výsledků oVŠ svým podpisem odpovídá za výsledky! oO každé fázi zpracování a kontroly musí existovat záznam – kdo, kdy oRazítka, podpisy oV PC – laboratorní pracovník zapisuje pod svým jménem oVŠ také ovlivňuje laboratorní pracovníky – měl by si všímat nálady na pracovišti, motivovat lidi, aby se nebáli přiznat chybu oJde o zdraví lidí, zatajování chyb nepřichází v úvahu Systém vyšetření autoprotilátek oELISA kity velice drahé – cca 10 tisíc oNapř. stanovení ENA – obsáhlá skupina autoprotilátek proti extrahovatelným nukleárním antigenům oVyšetření probíhá ve dvou fázích: 1. ELISA screening ENA: je pacient pozitivní na ENA? → ANO / NE 2. Pokud ANO – teprve se nasazuje na ELISU, která určí podtyp ENA (SS-A, SS-B, Jo1, Scl- 70, SM, …) Imunoblot oSlouží k diagnostice autoprotilátek oPříprava blotů (výrobce): o Proteiny elektroforeticky rozděleny v gelu – přenos (otisk) na nitrocelulózovou membránu (bloting) o Membrána je rozstříhána na jednotlivé diagnostické proužky o každý protein má na proužku definovanou polohu o Odečítá se podle přiložené šablony Imunoblot oPrincip stanovení: o Pokud je autoprotilátka proti určitému proteinu přítomna v séru, naváže se na tento protein imobilizovaný na stripu o Detekce vazby autoprotilátky pomocí detekčních protilátek značených enzymem o Enzym přemění substrát na barevný produkt o Výsledkem je vznik barevného proužku na stripu Imunoblot oJednotlivé barevné proužky se porovnávají s kontrolní šablonou oOdečet vizuálně nebo denzitometricky (% pozitivity) oImunoblotem se vyšetřují pacienti, které nelze vyšetřit jinou metodou (ELISA) oDiagnostika – zejména RS Imunofixace oDiagnostika monoklonálních gamapatií (stanovení paraproteinu v séru a moči) o Podezření na monoklonální gamapatie – zvýšená celková bílkovina > 90 g/l) o Monoklonální gamapatie neznámého významu - MGUS (monitoring – řada pacientů po čase přechází do mnohočetného myelomu, makroglobulinémie či primární amyloidózu) o Maligní monoklonální gamapatie – mnohočetný myelom, plazmocytom o Maligní lymfoproliferativní onemocnění o Waldenstromova makroglobulinemie o Maligní lymfomy o Chronická lymfatická leukemie o Nemoc těžkých řetězců o Primární AL amyloidóza Imunofixace Princip: oProteiny (sérum pacienta) rozdělné alkalickou elektroforézou jsou inkubovány se specifickými antiséry (anti IgG, IgA, IgM, řetězce kappa a lambda): oV případě pozitivní reakce vzniká precipitát, který zůstává v gelu imobilizován oOstatní proteiny jsou vymyty oPrecipitáty jsou obarveny kyselou violetí nebo amidočerní oHodnocení – vizuální Imunofixace Referenční stopa – veškeré proteiny fixovány fixačním roztokem Zbývajících 5 drah – na každou naneseno jiné specifické antisérum Imunofixační proužky jsou porovnávány s odpovídajícími frakcemi referenčního vzorku – proužek by měl mít stejnou migrační pozici Imunoelektroforéza oKombinace elektroforézy s imunodifuzí: oKrok 1: elektroforetické rozdělení séra oKrok 2: Podél migrační dráhy se vyřízne žlábek – aplikace polyvalentního antiséra o Antisérum difunduje do gelu – v zóně ekvivalence s antigenem (protein séra) vytvoří obloukovitou precipitační linii o Při použití polyspecifického antiséra – až 35 precipitačních obloučků – mají charakteristický tvar a polohu (1 oblouček = 1 protein) Imunoelektroforéza Imunoelektroforéza oDiagnostika monoklonálních gamapatií oHodnocení je kvalitativní oDnes spíše zastaralá metoda – nahrazena imunofixací Raketová imunoelektroforéza oUmožňuje kvantitativní stanovení proteinů (od 0,1 mg/l) oGel obsahuje monospecifické antisérum oProteiny séra elektroforeticky děleny (alkalické pH – anodická pohyblivost) oPři průchodu gelem vytváří cílový protein s monospecifickým antisérem precipitát v zóně ekvivalence →má tvar raketky oS1-S4 – standardy o různé koncentraci oV – vzorek pacienta oKvantitativní odečet z kalibrační křivky