1
STANOVENÍ KONCENTRACE PROTILÁTEK ACLA METODOU ELISA
Princip:
Vzorky séra jsou inkubovány v mikrotitračních destičkách v jamkách pokrytých specifickým
antigenem. Jsou-li ve vzorku séra pacienta přítomny odpovídající specifické protilátky, naváží
se na antigen. Nenavázaná frakce protilátek je odmyta. Poté je přidán konjugát, tj. protilátky
proti lidskému imunoglobulinu konjugované s enzymem. Během následné inkubace dojde
k navázání konjugátu na komplex antigen-protilátka, vzniklý v předchozím kroku.
Nenavázaný konjugát je odmyt. Poté přídavek substrátu vede k enzymatické reakci
s navázaným enzymem. Výsledkem je barevná reakce, která se zastaví přidáním kyseliny.
Intenzita zbarvení je úměrná koncentraci vyšetřované látky.
Pomůcky a materiál:
Postup:
1. Vytemperujte soupravu Aeskulisa ACLA G,M 30 min. při laboratorní teplotě.
2. Připravte si ředící roztok- 20 ml koncentrovaného ředícího roztoku doplňte destil. vodou
na celkový objem 100 ml.
3. Nařeďte příslušná séra pac. 1 : 100: (před ředěním promíchat)
do Eppendorfky napipetujte 500 ul naředěného ředícího roztoku + 5 ul séra.
( kalibrátory a kontroly ze setu jsou již připraveny k použití )
4. Vyndejte stripy s jamkami z obalu a umístěte do prvních pozic nosiče. Připravte si:
1 A-F : kalibrátory
1 G: negativní kontrola
1 H: pozitivní kontrola
na pozice dalšího stripu naředěná vyšetřovaná séra pacientů dle počtu dalších jamek.
5. Aplikujte kalibrátory, kontroly a naředěná vyš. séra pac.do jamek á 100 ul. Před aplikací
promíchat! Desku přikryjte víčkem a inkubujte 30 min. při lab. teplotě.
6. Připravte si promývací roztok: 20 ml koncentrovaného promývacího roztoku doplňte
destil. vodou na celkový objem 1000 ml.
7. Desku promyjte 3x
8. Aplikujte 100 ul konjugátu anti IgG (modrý) ev. anti IgM (zelený) – dle požadavku –
do každé jamky, konjugát v setu je připraven k použití.
Desku přikryjte víčkem a inkubujte 15 min. při 37 st.C v termostatu.
9. opakujte promytí
10. Aplikujte 100 ul substrátového roztoku TMB do každé jamky,
roztok v setu je připraven k použití.
Desku přikryjte víčkem a inkubujte 15 min. při 37 st.C v termostatu.
11. Aplikujte 100 ul stop činidla do každé jamky, roztok v setu je připraven k použití,
nechte 5 min. působit.
12. Na fotometru odečtěte OD v jednotlivých jamkách destičky při 450 nm
Pomocí kalibrační křivky jsou vypočítány koncentrace protilátek v PL/ml.
13. Výsledkový list podepište a označte pozice kontrol, kalibrátorů a měřených vzorků.
Na prvním listu - nahoře- tabulka hodnot naměřených OD všech jamek,
dole- hodnoty OD kalibrátorů proti jejich koncentracím do kalibrační křivky.
Na druhém listu jsou k jednotlivým pozicím přiřazeny v prvním sloupci hodnoty OD,
ve druhém hodnoty koncentrací.
Referenční meze pozitivní kontroly: 30 – 70 PL/ml
Odečtěte hodnoty koncentrací stanovených autoprotilátek jednotlivých pacientů v celých
číslech.
Závěr: (Popište co jste provedli za stanovení a jakou metodou, z jakého materiálu,
Uveďte i odečtený výsledek koncentrace dle výsledkového listu strany 2.)