1
VYŠETŘENÍ ANTI-NUKLEÁRNÍCH PROTILÁTEK (ANA)
Metoda: Nepřímá imunofluorescence
Princip testu:
Testovací souprava je určena pro in-vitro diagnostiku lidských protilátek v séru nebo plazmě.
Tkáňový substrát ( zde HEp-2 buňky) fixovaný na reakčním skle se inkubuje s naředěnými
pacientskými vzorky. Při pozitivní reakci se specifické protilátky třídy IgG, IgA, a IgM ze séra
pacienta naváží na antigeny přítomné v tkáňovém substrátu.Ve druhém kroku jsou navázané
protilátky obarveny pomocí detekčních anti-lidských protilátek značených fluoresceinem
(Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/FITC). V mezikrocích je třeba vymýt nenavázané složky.
Výsledky testu se odečtou fluorescenčním mikroskopem. Pozitivní séra lze titrovat. Titr séra
je definován jako převrácená hodnota nejvyššího ředění dávající pozitivní výsledek.
Pomůcky a reagencie: Reakční sklíčko, séra pac. 1 a 2, poz. a neg. kontrola, konjugát, krycí
sklíčko, obohacený PBS: 1 ml TWEEN + 0,5 l PBS, ...
Pracovní postup:
1. Nařeďte vyš. séra: (Před ředěním sérum důkladně promíchejte na vortexu)
- sérum pac. č. 1) 1 : 81 (= …. ul séra + …. ul PBS-TW)
a dále řeďte geometrickou řadou ze základního ředění 1 : 81 na: 1 : 160, 1 : 320,
1 : 640, 1 : 1280 tak, že smícháte ….ul naředěného séra a …. ul PBS-TW.
- sérum pac. č.2) 1 : 81 a dále řeďte na: 1 : 160 a 1 : 320.
Jako pozitivní a negativní kontrolu použijte ověřené sérum pacienta,
nařeďte základním ředěním 1 : 81
2. Po promíchání aplikujte naředěné kontroly a vyš. séra á 25 ul na místa na šabloně takto:
pozice 1 : pozitivní kontrola řeď. 1 : 81
2 : negativní kontrola řeď. 1 : 81
3 : vyš. sérum pac. 1) zákl. řeď.1 : 81
4 : 1) řeď. 1 : 160
5 : 1) řeď. 1 : 320
6 : 1) řeď. 1 : 640
7 : 1) řeď. 1 : 1280
8 : vyš. sérum pac. 2) zákl. řeď. 1 : 81
9 : 2) řeď. 1 : 160
10: 2) řeď. 1 : 320
3. Překryjte šablonu sklíčkem - reakčními místy dolů, inkubujte 30 min. při laboratorní tepl.
4. Opláchněte sklíčko opatrně proudem PBS-TW, nechte prát v PBS-TW 5 min.
(Umyjte šablonu: opláchněte vodou, vydesinfikujte Desprejem, nechte chvíli působit,
znovu opláchněte vodou a potom destilovanou vodou a osušte.)
5. Nařeďte konjugát: 250 ul PBS-TW + 5 ul koncentrátu
6. Aplikujte 20 ul naředěného konjugátu na očíslovaná místa na šablonu v polystyrenovém
nosiči, reakční sklíčko vyndejte z promývací lázně , opatrně osušte zadní stranu skla a
překryjte jím šablonu s nakapaným konjugátem. Inkubujte 30 min. při laboratorní teplotě.
7. Opláchněte sklíčko opatrně proudem PBS-TW, nechte prát v novém PBS-TW 5 min.
8. Umístěte krycí sklíčko do polystyrenového nosiče , nakapte kapku glycerinu na očíslovaná
místa. Vyjměte reakční sklíčko z promývací lázně, opřete spodní hranou o buničitou vatu
a opatrně otřete zadní stranu skla. Takto otřené sklo přitiskněte reakčními místy na
glycerinové kapky. Krycí sklíčko vycentrujte.
Závěr: (popište co jste provedli za vyšetření a jakou metodou)