Stanovení koncentrace specifického IgE v séru
1. Ke kuličce se streptavidinem ST je pipetován: alergen navázaný na rozpustné matrici
s biotinem B + pacientský vzorek (sérum Spec. IgE).
2. Následuje 30 min inkubace, kdy probíhá vazba alergen – protilátka a zároveň vazba
streptavidin – biotin, a tím zakotvení komplexu na kuličku.
3. Po inkubaci a promytí kuličky je pipetován konjugát (anti IgE s alkalickou fosfatázou
(enzym AF)).
4. Následuje 30 min inkubace, kdy probíhá vazba anti IgE na specifické IgE ze vzorku.
5. Po inkubaci a promytí je pipetován substrát. Dochází k reakci enzym – substrát.
Substrát je dioxetan-adamantyl-fosfát, který obsahuje vysoce energeticky bohatou
vazbu mezi 2 kyslíky, dále pyridinové jádro s fosfátovou skupinou PO3; alkalická
fosfatáza z konjugátu odštípne PO3, tím se celá molekula rozpadne a uvolní se vazba
mezi kyslíky, což se projeví luminiscencí.
6. Měří se počet fotonů za sekundu (CPS – counts per second) vyzařovaný při uvolnění
vazby. Měření se provádí až po 5 minutách inkubace se substrátem, kdy už je
luminiscence stabilní. Měření probíhá opakovaně a kontinuálně s korekcí pomocí filtrů
a fotonásobičů, aby měření probíhalo v optimálním koncentračním rozmezí.
Převzato z: https://www.siemens-healthineers.com/laboratory-diagnostics/assays-by-diseases-conditions/allergy