Biochemické vyšetření mozkomíšního moku MUDr. Zdeňka Čermáková OKB FN Brno Základní vyšetření ¡Počet elementů a erytrocytů –kvantitativní cytologie ¡Kvalitativní cytologie- trvalý cytologický preparát ¡Celková bílkovina ¡Glukóza ¡Laktát Celková bílkovina ¡Fyziologická hodnota 0,15 - 0,40 g/l (stoupá s věkem) lalbumin, prealbumin, transferin,imunoglobuliny lhaptoglobin, C-reaktivní protein, C3 a C4 složky komplementu, antitrombin III, α1-antitrypsin lorosomukoid. ¡ ¡Zvýš. CB lzáněty (porucha hematoencephal. bariéry) lporucha cirkulace likvoru lintratekální syntéza Ig ¡ Stanovení-fotometrie reakce s benzethoniumchloridem ¡ Glukóza ¡Základní energetický zdroj nervové tkáně ¡Hladina závisí na glykémii ( 60% sérové hladiny) ¡Snížení: lbakteriální meningitida lnádory lkrvácení ¡Metoda stanovení-fotometrie hexokinázová reakce Laktát ¡Fyziologická hodnota 1,2-2,1 mmol/l ¡Nezávisí na plazmatické koncentraci, prakticky neprochází přes hematoencephalickou bariéru ¡ ¡Zvýšení: lZáněty – rozlišení virové a bakteriální meningitidy (produkován hlavně bakteriemi při anaerobní glykolýze) lPoruchy zásobení mozku kyslíkem – ischemie, krvácení lZvýšení intenzity metabolismu – nádory Albumin ¡Tvorba v játrech ¡Albumin v likvoru pouze z obvodové krve ¡ ¡Referenční hodnoty: CSF-Albumin: 120–300 mg/l ¡ ¡Albuminový kvocient – Qalb = alb.CSF/ alb.S (je závislý na věku): ldo 15 let: ≤ 5×10−3 ldo 40 let: ≤ 6,5×10−3 ldo 60 let: ≤ 8×10−3 ¡ ¡Albuminový kvocient se využívá k matematickému vyjádření funkce hematolikvorové bariéry: ¡k hodnocení míry postižení hematolikvorové bariéry; ¡pro výpočet intratékální syntézy imunoglobulinů. ¡ ¡Metoda stanovení-imunoturbidimetrie,imunonefelometrie ¡ P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg The albumin quotient (QAlb) CSF albumin Serum albumin = Normal individuals Albumin quotient (QAlb) [USEMAP] Alternatively, quantitative IgG analysis may be used as a measure of intrathecal immunoglobulin synthesis. To ensure that measurements represent local (intrathecal) synthesis and not IgG which has diffused from the blood, values are corrected using albumin measurements. This serves as a marker of the blood-CSF barrier function because albumin is never synthesised within the CNS. For example, the IgG index is calculated as follows: P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg The albumin quotient (QAlb) CSF albumin Serum albumin = Impaired blood brain barrier Albumin quotient (QAlb) Alternatively, quantitative IgG analysis may be used as a measure of intrathecal immunoglobulin synthesis. To ensure that measurements represent local (intrathecal) synthesis and not IgG which has diffused from the blood, values are corrected using albumin measurements. This serves as a marker of the blood-CSF barrier function because albumin is never synthesised within the CNS. For example, the IgG index is calculated as follows: Porucha hematolikvorové bariéry ¡Mírně porušená 7.3-10x 10-3 ¡ Roztroušená skleróza, chronické neuroinfekce, serózní meningitidy,nezánětlivé polyneuropatie ¡ ¡Střední porucha 10-20x 10-3 ¡ Serózní meningitidy,CMP,diabetická neuropatie ¡ ¡Těžká porucha nad 20 x 10-3 ¡ Meningitida bakteriální,herpetická, tuberkulózní,karcinomatóza,polyradikuloneritida-Guillaina-Barrého ¡I při velmi vysokých hodnotách Qalb. je zachována určitá funkčnost bariéry Imunoglobuliny ¡Zdroj – sérum ¡Lokální syntéza(intratékální) l lCSF-IgG: 12,0–40,0 mg/l lCSF-IgM: 0,2–1,2 mg/l lCSF-IgA: 0,2–2,1 mg/l ¡ ¡ Intratékální syntéza ¡ perivaskulární infiltráty lymfocytů B, které lokálně proliferují dozrávají v plazmocyty a produkují protilátky ¡ ¡Princip měření – imunochemicky, turbidimetrie, nefelometrie ¡ ¡ ¡ Humorální imunitní reakce v CNS ¡Dg. imunitní reakce v CNS l lIgG index ¡ lVýpočet dle Reibera ¡ lKvalitativní-izoelektrická fokuzace – průkaz oligoklonálních proužků IgG_{index} = \frac{Q_{IgG}}{Q_{alb}} IgG _{index} = \frac{IgG_{CSF}/IgG_{s\acute{e}rum}}{Alb_{CSF}/Alb_{s\acute{e}rum}} P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg Protein Reference Unit Handbook IgG index = CSF albumin Serum albumin QAlb QIgG CSF IgG Serum IgG = Alternatively, quantitative IgG analysis may be used as a measure of intrathecal immunoglobulin synthesis. To ensure that measurements represent local (intrathecal) synthesis and not IgG which has diffused from the blood, values are corrected using albumin measurements. This serves as a marker of the blood-CSF barrier function because albumin is never synthesised within the CNS. For example, the IgG index is calculated as follows: P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg Protein Reference Unit Handbook CSF albumin Serum albumin CSF IgG Serum IgG = Normal individuals Alternatively, quantitative IgG analysis may be used as a measure of intrathecal immunoglobulin synthesis. To ensure that measurements represent local (intrathecal) synthesis and not IgG which has diffused from the blood, values are corrected using albumin measurements. This serves as a marker of the blood-CSF barrier function because albumin is never synthesised within the CNS. For example, the IgG index is calculated as follows: P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg Protein Reference Unit Handbook CSF albumin Serum albumin CSF IgG Serum IgG = Impaired blood brain barrier Alternatively, quantitative IgG analysis may be used as a measure of intrathecal immunoglobulin synthesis. To ensure that measurements represent local (intrathecal) synthesis and not IgG which has diffused from the blood, values are corrected using albumin measurements. This serves as a marker of the blood-CSF barrier function because albumin is never synthesised within the CNS. For example, the IgG index is calculated as follows: P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg Protein Reference Unit Handbook CSF albumin Serum albumin CSF IgG Serum IgG = Multiple sclerosis Alternatively, quantitative IgG analysis may be used as a measure of intrathecal immunoglobulin synthesis. To ensure that measurements represent local (intrathecal) synthesis and not IgG which has diffused from the blood, values are corrected using albumin measurements. This serves as a marker of the blood-CSF barrier function because albumin is never synthesised within the CNS. For example, the IgG index is calculated as follows: Výpočet dle Reibera Reiberův_diagram.png (780×720) Oblast 1 – normální nález; Oblast 2 – izolovanou poruchu hematolikvorové bariéry bez lokální syntézy Ig Oblast 3 – poruchu hematolikvorové bariéry společně s intratékální syntézou I Oblast 4 – izolovaná intratékální syntéza Ig bez poruchy hematolikvorové bariéry; Oblast 5 – oblast analytických chyb. Vyjádření intratékální protilátkové odpovědi 18 P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg Reibergram Normal Intrathecal Ig synthesis QAlb QIgG Interpretace patologických nálezů s ohledem na funkci hematolikvorové bariéry a intratékální syntézu: ¡Porucha funkce HLB bez intratékální syntézy:polyradikuloneuritida Guillain-Barré, akutní stadium purulentní meningitidy, tumory CNS ¡ ¡Porucha funkce HLB s intratékální syntézou:purulentní meningitidy, TBC meningitidy a mozkový absces, neurolues a herpetická encefalitida,neuroborrelióza ¡ ¡Intratékální syntéza se zachováním funkce HLB:roztroušená skleróza, HIV a některé další virové encefalitidy. ¡ Výpočet dle Reibera ¡ ¡Q Lim(IgG) = 0,93 x √QAlb2 + (6x10-6) – 1,7 x 10-3 ¡ ¡QLim(IgM) = 0,67 x √QAlb2 + (120x10-6) – 7,1 x 10-3 ¡ ¡ ¡ IgGLOC = (QIgG –QlimIgG) x IgGs (mg x 1-1) ¡ ¡ IgGITH = (1-QlimIgG/QIgG) x 100% ¡ Kvalitativní-izoelektrická fokuzace – průkaz oligoklonálních proužků ¡Elektroforéza v gradientu pH – rozdělení podle izoelektrického bodu jednotlivých bílkovin ¡ ¡Současně se analyzuje i sérum ¡ ¡Významný je nález, kdy nacházíme proužky v likvoru, které nejsou v séru – znamená intratekální syntézu Ig ¡ ¡ C:\Users\3050\Desktop\IMG_2411.JPG 25 C:\Users\3050\Desktop\IMG_2415.JPG 26 27 \\fnbrno.cz\tree\Home\3050\My Pictures\2017-04-28\085.JPG \\fnbrno.cz\tree\Home\3050\My Pictures\2017-04-28\087.JPG 28 P:\Technical Directors shared documents\Wikilite\Main page design\TBS logo black JPG.jpg B C Normal OCB in CSF only: Intrathecal IgG synthesis Additional OCB in CSF: Intrathecal IgG synthesis Identical OCB in Serum and CSF: Systemic infection Oligoclonal bands (OCB) Monoclonal IgG: Identical in Serum and CSF MS MS Reiber et al. http://www.ifcc.org/ejifcc/vol15no3/150309200412.htm Figure 1. Isoelectric focussing on agarose gels with immunoblot: The figure represents the classical types 1 – 5 (Andersson et al. 1994): • Type 1: No bands in CSF and serum. • Type 2: Oligoclonal IgG-bands in CSF, not in serum. Interpretation: Intrathecal IgG-synthesis. • Type 3: Oligoclonal bands in CSF (like type 2) and additional identical oligoclonal bands in CSF and serum (like type 4). Interpretation: Intrathecal IgG-synthesis • Type 4: Identical oligoclonal bands in CSF and serum. Interpretation: No intrathecal IgG-synthesis but systemic immune reaction. • Type 5: Monoclonal bands in CSF and serum. Interpretation: Systemic paraproteinaemia. The number of OCBs have been suggested to be associated with worse disease Mention concept of inrathecal syntehsis I am sure you can appreciate, these gels can and are diffiuclt to interpret MRZ reakce ¡specifická reakce MRZ (morbilli, rubeola a varicella zoster) ¡Jako reakce MRZ se označuje intratékální syntéza specifických protilátek třídy IgG proti neurotropním virům spalniček, zarděnek a planých neštovic. ¡ ¡Přítomnost reakce MZR je vysvětlována moderní teorií imunitní sítě, ve které každá imunologická reakce indukovaná konkrétním antigenem postihuje celou imunitní síť.Kromě specifických protilátek proti vyvolávajícímu agens je zvýšena produkce mnoha dalších protilátek a autoprotilátek Perspektivy vývoje vyšetření likvoru ¡Diagnostika degenerativních onemocnění a prionových infekcí. Dg. Creutzfeldtovy-Jakobovy choroby svědčí zvýšená koncentrace 14-3-3 proteinu v likvoru ¡Likvorová diagnostika Alzheimerovy choroby se opírá o stanovení β-amyloidu,τ-proteinu a fosfo- τ-proteinu. Protein β-amyloid je součástí amyloidových plak, které se akumulují v mozku. Protein τ se vyskytuje v cytoskeletu CNS. U Alzheimerovy choroby se nachází snížené hodnoty β-amyloidu a zvýšené hodnoty τ-proteinu.Dále se hodnotí jejich vzájemný poměr, index τ/ β-amyloid, který bývá zvýšený. ¡ ¡Strukturální protein S-100 patří do rodiny proteinů vážících vápník. Zvýšená hodnota S100 může svědčit pro poruchu hematolikvorové bariéry a často je známkou neuronového postižení. ¡β2 mikroglobulin patří k proteinům, které jsou přítomny ve všech tělních tekutinách.Vzestup jeho koncentrace v likvoru nacházíme u stavů obecně spojených s aktivací a zmnožením lymfocytárních a makrofagických elementů. Spektrofotometrie likvoru ØProvádí se při podezření na intermeningeální krvácení. ØJe přínosné v časných stadiích, kdy ještě nejsou změny v cytologickém obrazu. Ø ØSpektrofotometrie je 10x citlivější než lidské oko, pozitivní nález můžeme získat i u napohled bezbarvého likvoru. Ø ØProvádí se registrací absorbance v oblasti viditelného světla (380-700 nm), detekuje se přítomnost oxyhemoglobinu a bilirubinu. Ø Spektrofotometrie likvoru Ø Spektrofotometrie_oxy_a_bili Průkaz likvorey ØLikvorea – závažný stav s komunikací likvorových cest Detekce likvoru je možná stanovením parametru specifického pro likvor. Ø ØStanovení beta trace proteinu – enzym, který je syntetizován v buňkách chorioideálního plexu. V likvoru se nachází v koncentracích 20-30x vyšších než v séru. ØDalším parametrem je β2 transferin. Ze sérového transferinu se v likvorových prostorách odštěpí zbytky kyseliny sialové (mozkovou neuraminidázou), vzniká asialotransferin, který lze detekovat pomocí elektroforézy s imunofixací v β2 zóně. Ø Stanovení beta 2 transferinu Ø Obrázek1 Obrázek2