1 Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 1: Úvod 2 Dnes máme na programu •Co je to mikrobiologie •Co je to humánní klinická mikrobiologie •Co je to laboratoř klinické mikrobiologie (hlavně bakteriologie), jak funguje a proč funguje právě tak, jak funguje •Které jsou lékařsky významné mikroby a kterými metodami je zkoumáme 3 Zkouška, literatura •Zkouška z lékařské mikrobiologie – – na konci druhého semestru. Má praktickou a teoretickou část. U teoretické části si vytáhnete trojici otázek. Otázek je celkem 120 •Doporučenou knihou je Miroslav Votava a kol. „Lékařská mikrobiologie – vyšetřovací metody“. Prezentace z přednášek budou postupně viset na ISu ve „Studijních materiálech“ spolu s dalšími materiály, které vám poskytneme. 4 Náš ústav Provoz (analýza klinických vzorků) Výuka Výzkum Obrázek1 Foto: Archiv MU 5 Medici ve velké praktikárně PC210117 Foto: Archiv MU 6 Historie mikrobiologie •První mikroby („animalcula“) pozoroval Antony van Leeuwenhoek, díky tomu, že jako první sestrojil dostatečně zvětšující mikroskop •Zásluhu na dnešní podobě mikrobiologie mají Louis Pasteur a Robert Koch, kteří propracovali mikrobiologické metody a popsali mnoho jednotlivých druhů bakterií 7 Historie klinické mikrobiologie a imunologie •Klinická mikrobiologie se jako samostatný obor odštěpila začátkem 20. století z patologie. Do té doby se diagnostikou mikrobiálních původců ve vzorcích pacientů zabývali patologové •O více než půlstoletí později se z mikrobiologie vyčlenila imunologie, tedy věda o obranyschopnosti organismu. 8 Humánní klinická mikrobiologie – co to je •Je to průnik množiny všelijakých mikrobiologických oborů a množiny lékařských oborů. •Pro lékaře jsme příliš mikrobiologičtí. Pro mikrobiology z přírodovědecké fakulty jsme příliš lékařsky zaměření… •Veterináři nám nadávají (a mají někdy pravdu), že si myslíme, že klinická mikrobiologie je jen ta humánní. Ve skutečnosti existuje i veterinární obdoba – veterinární klinická mikrobiologie 9 Klinická mikrobiologie Humánní klinická mikrobiologie Veterinární klinická mikrobiologie Obecná mikrobiologie Molekulární biologie a genetika Buněčná biologie Infekční lékařství Dermato- venerologie Epidemiologie infekčních nemocí Mikrobiologie rostlin 10 Kdo jsou mikrobiologové Klinická mikrobiologie Průmyslová mikrobiologie Jiné medicínské obory Chemicko- technologic. školy Přírodovědecké a podobné fakulty Lékařské fakulty Základní mikrobiologický výzkum Na našem ústavu jsou lékaři a další odborníci. 11 69 virus-HIV-01 Virus HIV http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm 12 Co nás čeká v tomto předmětu •Povídání o určování mikrobů a vůbec o práci v laboratoři klinické mikrobiologie •Povídání o klinicky významných mikrobech a jejich vlastnostech •Něco o dekontaminaci a antibioticích •Drobné exkurze do styčných oblastí mezi mikrobiologií, imunologií, epidemiologií apod. 13 74 virus-ebola-Filoviridae Ebola http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm 14 Co je to mikrob?! •Musí to být živé. Zrníčko prachu není mikrob, i když je mikroskopické •Musí to být mikroskopické. Žirafa není mikrob, i když je živá •Z druhé podmínky se připouštějí výjimky. Třeba tasemnice patří do mikrobiologie přesto, že mohou mít deset metrů. Ale jejich vajíčka jsou mikroskopická. 15 G+ koky • Foto DVH 16 Bakterie na kultivačních půdách 17 Co jsou všechno mikroby •Mikroby jsou tedy například mikroskopické řasy a sinice, archea – stáří 3,5 biliónu let –schopné vydržet v extrémních podmínkách (extremofilové) –teplota, pH, koncentrace soli –hluboko pod mořem nebo horkých pramenů –v půdě, v mořské vodě (součást planktonu) –jsou zajímavé a úžasné 18 Co tyhle mikroby umí •Přežívají v moři v hloubce 10 km •Přežijí i teploty kolem 110 °C •Vydrží značnou radioaktivitu •Jsou schopny místo kyslíku „dýchat“ síru či dusík (zkrátka, mají jiný akceptor elektronů než atom kyslíku) •Hrají významnou roli v koloběhu prvků, zejména uhlíku, dusíku a síry •Mnoho věcí ovšem umějí i mikroby lékařsky významné, jak si povíme dále 19 18 meningokokken_250 Neisserie www.meningitis.de/erreger/meningokokken.html. 20 Třídění živých organismů •Priony – neobsahují DNA, většinou se vůbec nepovažují za živé organismy •Viry a bakteriofágy •Buněčné organismy –Archea (archeobakterie) –Eubacteria (eubakterie) –Eucarya (eukaryotní organismy) •jednobuněčné •mnohobuněčné mimivirus 21 Klinicky významné mikroby •Klinicky významné mikroby jsou takové, které jsou významné pro lidské tělo •„Významné pro tělo“ ani zdaleka není totéž jako „tělu škodlivé“. Naopak, mnohé jsou neškodné, nebo dokonce pomáhají •Každý organismus má své klinicky významné mikroby: člověk, každý druh zvířete či rostliny. Dokonce i mikroby (třeba bakterie) mají své mikroby (bakteriofágy). 22 • phages--80000x-0025c http://www2.warwick.ac.uk/fac/sci/lifesci/research/facilities/imaging/imagegallery/phages--80000x-0 025c.jpg 23 Hlavní klinicky významné mikroby (a jiné organismy) •Viry (a priony) •Bakterie (třeba streptokok, Escherichia) •Houby (kvasinky a plísně) •Paraziti – přesahují pojem mikrob: –Vnitřní paraziti •Prvoci (např. původce malárie) •Motolice (např. motolice jaterní) •Hlístice (např. roup nebo škrkavka) •Tasemnice (např. tasemnice dlouhočlenná) –Vnější paraziti (většinou členovci, tedy například vši, blechy, štěnice) 24 Humánní klinická mikrobiologie se proto dělí na podobory: •lékařská bakteriologie •lékařská virologie •lékařská mykologie •lékařská parazitologie •někdy se ještě zvlášť vyčleňuje sérologie, tj. obor, který se zabývá průkazem protilátek proti mikrobům, případně i průkazem antigenů v séru (nejen) Foto M.DH 25 Co nás zajímá o mikrobech morfologie jaký mají tvar a uspořádání struktura z čeho se skládají fyziologie jak se chovají metabolismus jak a čím se živí odolnost jak vzdorují výkyvům podmínek vnějšího prostředí klasifikace jak jsou vzájemně příbuzné 26 Co nás zajímá o klinicky významných mikrobech patogenita které orgány osidlují a jak patogeneze jakým způsobem případně škodí přenos jak se přenášejí inkubační doba jak dlouho trvá, než se projeví diagnostika jak je můžeme poznat léčba a prevence co proti nim můžeme dělat 27 Rozdělení virů •DNA viry, například –herpesviry – HSV, VZV, EBV, CMV, HHV6 –adenoviry – některé respirační virózy –papovaviry – například urogenitální papilomaviry –parvoviry – například původce páté dětské nemoci –virus žloutenky B •RNA viry, například –enteroviry – polio, coxsackie, ECHO –rhinoviry – viry rýmy –viry chřipky, parachřipky, spalniček, zarděnek, příušnic –viry žloutenek A, C, D, E –různé viry klíšťových encefalitid, tropických viróz, vztekliny, horeček Lassa a Ebola –virus HIV 28 Rozdělení bakterií 1 •podle tvaru a uspořádání –koky – kulovité, tvoří dvojice, řetízky, shluky… –tyčinky – protáhlé, mohou být rovné, zahnuté… –kokotyčinky (kokobacily) – mezi koky a tyčinkami –spirochéty – ve tvaru spirály –bez tvaru – např. mykoplasmata •podle tzv. Gramova barvení (dáno typem buněčné stěny) –grampozitivní – barví se fialově –gramnegativní – barví se červeně –Gramem se nebarvící – jiný typ stěny či bez stěny Rozdělení bakterií 29 bacillus-sp haemophilus gnty Foto DVH 30 Rozdělení bakterií 2 •podle vztahu ke kyslíku –striktně aerobní (rostou pouze v přítomnosti kyslíku) –striktně anaerobní (vyžadují atmosféru bez kyslíku) –fakultativně anaerobní („přepínají“ metabolismus) –aerotolerantní (v praxi neodlišitelné od předchozích) –mikroaerofilní (potřebují kyslík, ale musí ho být málo) –kapnofilní (potřebují kyslík, ale také zvýšený podíl CO2 v atmosféře) •v praxi často jen aerobní / anaerobní 31 Přehled klinicky významných bakterií, o kterých bude hodně řeč: část první •Nejdůležitější grampozitivní koky: –Staphylococcus: S. aureus, koaguláza-negativní stafylokoky –Streptococcus: hemolytické, viridující, streptokoky bez hemolýzy (gamahemolytické) –Enterococcus: E. faecalis, E. faecium 32 NeEc1 33 Část druhá •Nejdůležitější grampozitivní tyčinky: –Listeria, Corynebacterium, Bacillus (ten je sporulující, tj. tvoří spory) •Nejdůležitější gramnegativní koky: –Neisseria (N. gonorrhoeae – „gonokok“, N. meningitidis – „meningokok“, „ústní“ neisserie) –Moraxella catarrhalis – také Branhamella catarrhalis 34 Část třetí •Nejdůležitější gramnegativní tyčinky: –Enterobakterie: obligátní patogeny: Salmonella, Shigella, Yersinia; oportunní patogeny: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Providencia, Morganella, Serratia, –Gramnegativní nefermentující tyčinky (popř. i kokotyčinky, event. koky): Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, Burkholderia, Stenotrophomonas –Ostatní: Haemophilus, Pasteurella (rány po pokousání psem); Campylobacter, Helicobacter; Vibrio (např. V. cholerae); Legionella, Bordetella Francisella 35 Část čtvrtá •Nejdůležitější anaeroby: –Clostridium (C. tetani, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens a jiná tzv. „klostridia plynatých snětí) – grampozitivní sporulující tyčinky –Actinomyces – původce aktinomykózy –Ostatní anaeroby většinou působí ve směsi. Např. Propionibacterium, Peptococcus, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium či koky Veillonella gramnegativní. 36 Část pátá •Nejdůležitější spirochety: –Treponema, Borrelia, Leptospira •Nejdůležitější z ostatních bakterií: –Mycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae), Mycoplasma (M. pneumoniae, M. hominis), Ureaplasma (U. urealyticum), rickettsie, chlamydie 37 Diagnostika: průkaz a určování mikroorganismů •Klinická mikrobiologie v praxi spočívá v tom, že lékař (ať už je to obvodní lékař, ambulantní specialista či lékař z kteréhokoli oddělení nemocnice) pošle do laboratoře vzorek •Úkolem klinickomikrobiologické laboratoře je prokázat v takovém vzorku případnou přítomnost mikrobů a pokud tam jsou, tak je také určit. 38 Co je to vzorek •Vzorek je to, co je odebráno pacientovi a přichází na vyšetření do laboratoře, většinou: •kusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) •stěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle zanořeném do transportního média. •Při diagnostice někdy pracujeme s celým vzorkem. Jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů. 39 Co je to kmen •Kmen je čistá kultura („výpěstek“) jednoho druhu mikroba •Kmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě. •Kochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie. 40 Cíle mikrobiologického vyšetření •Zjištění mikrobiálního agens –přímo (prokážeme mikroba, jeho součást či produkt ve vzorku; v případě izolačních metod sem patří i identifikace kmene) –nepřímo (prokážeme protilátky, které si makroorganismus vytvořil jako odezvu na antigenní výzvu) •Jen někdy též: zjištění in vitro citlivosti mikrobiálního agens na antimikrobiální látky (kultivovatelné bakterie a houby) 41 Přehled metod •Metody přímé: Hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální jed – toxin) –Přímý průkaz ve vzorku – pracujeme s celým vzorkem (močí, krví, výtěrem z krku a podobně) –Identifikace kmene – určení vypěstovaného izolátu •Metody nepřímé: Hledáme protilátky. Protilátka není součástí ani produktem mikroba – je produktem makroorganismu, odezvou na činnost mikroba 42 Přehled metod přímého průkazu Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie – sledování příbuznosti kmenů 43 Proč se mikrobiologická diagnostika zabývá nejvíc bakteriemi •Houby a paraziti, při vší úctě, způsobují relativně méně onemocnění člověka než viry a bakterie. Problematika mykologie a parazitologie je hodně speciální a moc se nehodí do všeobecné mikrobiologie •Zabývat se viry je obtížné a zatím to nemá zpravidla příliš velký praktický dopad (to „zatím“ znamená, že situace se možná změní po praktickém zavedení zjišťování citlivosti na antivirotika) 44 Proč je méně klinických virologů než bakteriologů •Mnohá virová onemocnění (hlavně dětská) se projevují typickými klinickými příznaky a nevyžadují laboratorní diagnostiku •Mnohá virová onemocnění se neléčí kauzálně, tj. léčí se pouze příznaky. Je-li tomu tak, není nutno bezpodmínečně znát původce. •Virologická diagnostika je obtížnější a dražší a proto se pro ni rozhodujeme jen když je opravdu pádný důvod 45 Jak je organizována laboratoř klinické mikrobiologie •Příjem vzorku. Dobrý primář se pozná podle toho, že ví, že právě příjem je nejdůležitější součástí laboratoře. •Vlastní vyšetření. Pokud je kultivační, trvá několik dnů až mnoho týdnů (některé viry, plísně, mykobakteria). Některá jiná (mikroskopie, průkaz antigenu) mohou být hotová během několika desítek minut. •Expedice výsledku v takové formě, aby umožnila správnou interpretaci 46 Rozdíl mezi klinickou bakteriologií a bakteriologickým výzkumem •Badatel má relativně dost času. Když mu to dlouho trvá, nikdo na něj vztekle neřve do telefonu. •Badatel na druhou stranu musí diagnostikovat přesně. Klinickému mikrobiologovi jeho klienti rádi odpustí, pokud bakterii určí jen rodově či skupinově, jen když to rychle. •Klinika ostatně více zajímají léčebné možnosti, než přesný název mikroba. 47 Rozdíl mezi klinickou mikrobiologií a klinickou biochemií – 1 •Doba biochemického stanovení závisí převážně na organizaci práce v.biochemické laboratoři •Doba mikrobiologického vyšetření závisí převážně na tom, jak rychle se těm potvůrkám uráčí vyrůst; sebeúpornější a sebezavilejší ortoped či doktor z ARK jim nedokáže poručit. Neplatí to ovšem u metod, kde se mikroby nekultivují 48 Rozdíl mezi klinickou mikrobiologií a klinickou biochemií – 2 •Biochemik (ale i serolog) pracuje takto: –Stanovení 1 à výsledek 1 –Stanovení 2 à výsledek 2 –Stanovení 3 à výsledek 3 •Bakteriolog pracuje jinak: –Vzorek à metoda à podle výsledku případně kupa dalších metod à možná časem i nějaký výsledek –Bakteriologie se mnohem hůř automatizuje 49 Rozdíl mezi klinickou mikrobiologií a klinickou biochemií – 3 •Dalším rozdílem jsou i typy vzorků. Biochemici pracují téměř výhradně se sérem, plazmou a močí. Mikrobiolog u nepřímého průkazu rovněž pracuje se sérem. U přímého průkazu je však nutno použít vzorek odpovídající lokalizaci mikroorganismu. A to může být skoro cokoli. 50 Typy vzorků •Tekuté a kusové materiály se zasílají zpravidla ve sterilních nádobkách různého tvaru a velikosti. Může to být krev, moč, mozkomíšní mok a různé jiné tělní tekutiny •Výtěry a stěry se zasílají zpravidla zanořené do transportní půdy, nejčastěji Amiesovy •Zvláštní případy: zaslání sklíčka s nátěrem, speciální odběrové soupravy (hemokultury) aj. 51 Algoritmy •Bakteriologické vyšetření je ve své podstatě algoritmus. Je podobné kriminalistice – postupně se zužuje okruh podezřelých, až je pachatel usvědčen. (A jako v kriminalistice, i zde mohou nastat „justiční omyly“) 52 Stafylokoky Příklad Diagnostika stafylokoků. Poté, co zjistíme, že náš kmen je grampozitivní kok, určujeme ho dalšími testy. Přitom vědomě pomíjíme klinicky nevýznamné a vzácné rody a druhy. Riziko omylu ovšem musí být přijatelné. 53 Časový faktor •V „den 0“ obvykle pouze přijde vzorek. Provést lze leda mikroskopii, přímý průkaz antigenu ve vzorku či průkaz DNA •V „den 1“ či „den 2“ je k dispozici výsledek kultivace. Když je podezřelý nebo pozitivní, pokračuje diagnostika do dalšího dne •Negativní výsledky se expedují v „den 1“ nebo „den 2“, pozitivní v „den dva až „den 5“ podle situace 54 Den 0. (přijatá stolice) •Negativní výsledek je za 48h •Pozitivní za 72h a později selenit 24 h 48 h identifikace endo endo XLD MAL MCs KA Nacl CCDA CIN + 72h 42°C 28°C *Není-li uvedeno jinak, kultivace probíhá při 37°C Příklad Obrázek L. Černohorské 55 DSCN1898 Na shledanou příště