Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 2: Morfologie bakterií, mikroskopie Upraveno podle MUDr. O. Zahradníčka 2 Morfologie a fyziologie, mikroskopie a kultivace Morfologie bakterií (složení, tvary, uspořádání, sporulace) Fyziologie bakterií (množení, metabolismus, využívání substrátů) Mikroskopické pozorování (= pozorování mikroba jako morfologické jednotky) Kultivace (= pozorování růstových, tedy fyziologických vlastností mikroba) 3 Morfologie bakteriální buňky •Prokaryota –Chybí ohraničené jádro –DNA ve formě cirkulárního chromozomu –Transkripce a translace mohou probíhat současně https://slideplayer.cz/slide/2677606/ 4 Z čeho se skládá bakteriální buňka •Chromozom - nukleoid •Ribozomy, nutné k proteosyntéze •Cytoplasma, prostředí uvnitř buňky •Cytoplasmatická membrána •Buněčná stěna •Vakuoly, buněčné inkluze – dočasná záležitost •Plasmidy •Bičíky a fimbrie •Pouzdro Vždy 5 Buňky Streptococcus pneumoniae crosssection_streptococcus www.uni-tuebingen.de 6 Genetická informace bakteriální buňky •Chromozom kruhového tvaru –nukleoid není viditelný v optickém mikroskopu –neobsahuje introny •Kromě chromozomu může být genetická informace i extrachromozomální - plazmidy •Malé kruhové molekuly DNA –obsahují přídatnou genetickou informaci –replikují se autonomně –postradatelné 7 Jak může buňka přijít k plazmidu •Buňka nemůže plazmid sama vyrobit •tři způsoby: transdukce, transformace a konjugace •Pro různé bakterie je typický ten nebo onen, anebo žádný způsob •Je to i prakticky významné – plazmidy kódují např. rezistenci na antibiotika, produkci toxinů, produkci antibiotik 8 Transdukce Fragment chromozomální DNA max. odpovídající přibližně délce genomu fága je omylem vbalen do kapsidy místo vlastní DNA fága Rozšířený: bacillus, corynebacterium, escherichia, klebsiella, streptococcus a staphylococcus 9 Konjugace Autonomně přenosné plazmidy, konjugační pili u G- bakterií, u G+ „sex feromonem“ buňky se přiblíží a přilnou - streptokoky 10 Transformace 11 Ribozómy •Ribozómy jiné než v eukaryotních buňkách •Volně v cytoplazmě •Poblíž nepravého jádra •Poblíž cytoplazmatické memrány – syntetizují bílkoviny určené do membrány •Dvě podjednotky 30S a 50S; 70S 12 Cytoplazma •Cytoplazma – velmi viskózní •obsahuje –50 % bílkovin buňky – všechny mají enzymatickou funkci – enzymy glykolýzy, Krebsova cyklu, dehydrogenázy, esterázy, katalázy –přijaté živiny, zplodiny metabolismu, ionty –obsahuje velké množství biogenní molekul Cytoplazmatická membrána •Jediná biologická membrána prokaryotické buňky •probíhá na ní řada chemických procesů •transport látek do buňky •transformace energie – respirační řetězec •procesy, které využívají rozdílu v koncentraci určitých iontů vně a uvnitř buňky •Protonový gradient - pohání bičík •Membrána zároveň chrání buňku před chemickými a jinými vlivy • 13 14 Buněčná stěna •Má roli buněčného skeletu – uděluje buňce tvar a chrání ji mechanicky, chemicky, proti vyschnutí, nepříznivým osmotickým podmínkám • •Obnažené buňky s cytoplazmatickou membránou –Protoplasty –Sféroplasty –L-formy bakterií Buněčná stěna •Hlavní složka peptidoglykan (murein) z cukrů (N-acetylglukosamin a N-acetylmuramová kyselina) a aminokyselin •Barvení dle Grama – základní metoda identifikace a detekce bakterií • 15 Buněčná stěna •Grampozitivní bakterie mají buněčnou stěnu tlustou (20-80 nm) a jednoduchou •Gramnegativní bakterie mají buněčnou stěnu tenkou (5-10 nm) a složitější •Některé bakterie mají jinou buněčnou stěnu (mykobakteria – acidorezistentní, v buňce jsou mykolové kyseliny) •Některé bakterie (mykoplasmata) buněčnou stěnu vůbec nemají • 16 17 Základem každé buněčné stěny je peptidoglykan (murein) peptidoglycan www.arches.uga.edu 18 Grampozitivní buněčná stěna gm+%20cell%20wall www.arches.uga.edu 19 gm-%20cell%20wall Gramnegativní buněčná stěna www.arches.uga.edu Gramnegativní buněčná stěna •Lipid A = endotoxin - hydrofobní •Nespecifický polysacharid (základní polysacharid) – společný pro příbuzné druhy bakterií •Specifický polysacharid – je nositelem antigenicity těla bakterie – O antigen u G- bakterií •Vnější membrána – propouští živiny, chrání před lytickými účinky žlučových kyselin, enzymů (např. střevního traktu, lysozymu •LPS – chrání pře imunitní protilátkovou odpovědí 20 21 Fimbrie (pili), curli a bičíky •Mnohé bakterie jsou schopny pohybu –K pohybu slouží hlavně bičíky –Bičík bakterií – rotuje jako lodní šroub, až 20 µm, proteinem - flagelin – druhově specifický •Fimbrie mohou vedle pohybu sloužit např. i k adhezi bakterie na povrch, ke konjugaci (sex pili), větší množství může chránit před fagocyty hostitele •Curli jsou podobné jako pili, ale zakroucené 22 Bakterie s bičíky (Escherichia coli) 03 escherichia_coli_1 www.biotox.cz 23 Umístění bičíků bakterií • 220px-Flagella Počet a uspořádání bakteriálních bičíků: A. monotricha, B. lofotricha, C. amfitricha, D. peritricha http://cs.wikipedia.org/wiki/Bi%C4%8D%C3%ADk 24 streptococcus_pneumonia050217 Pouzdro a biofilm •Pouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. –většinou polysacharidové, které buňku chrání – slizovitý povrch –faktor virulence •Biofilm je souvislá vrstva, vzniklá z bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. –je mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě www.cbc.ca 25 Stádia vývoje biofilmu •Kontakt planktonické bakterie s povrchem + •navázání na tento povrch •adhese, růst a shlukování buněk do mikrokolonií •produkce polymerické hmoty (matrix, nebuněčná složka) •Vytvoření trojrozměrné struktury známé jako biofilm • •(Převzato z prezentace dr. Černohorské) 26 Neobarvené pouzdro •V barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí pak dobarveno tuší, tuší se pak pouzdro tam, kde se nic neobarvilo 05 Burri pathmicro.med.sc.edu 27 Sporulace •Sporulace je něco jako zimní spánek, ale dovedený oproti zimnímu spánku zvířat k mnohem větší dokonalosti •Spory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně •Spora vzniká jako endospora (uvnitř buňky): buňka se dělí asymetricky •z menší poloviny – endospora obsahuje kompletní genom a malé množství proteosyntetického aparátu - obalená mnoha vrstvami •je zavzata do té druhé větší poloviny •spora obsahuje jen minimum vody •vysoká odolnost k zvýšené teplotě •velké množství kys. dipikolinové a Ca2+ Spora 28 http://www.textbookofbacteriology.net/structure_10.html 22 Genre%20Bacillus membres.lycos.fr Sporulující bakterie r. Bacillus a r. Clostridium 29 Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví bacillus-sp 30 Tvarové možnosti bakterií •Koky (kulaté, protáhlé, ploché) •Kokotyčinky •Tyčinky (rovné, zahnuté, s oblými či špičatými konci, tlusté, tenké) •Vláknité bakterie (zvláštní případ tyčinek) •Spirální bakterie – spirochety •Beztvaré bakterie, např. mykoplasmata 31 Zprohýbaná tyčinka – helikobakter 39 helicobacter%20pylori vietsciences.free.fr 32 Spirochéty 11 treponema 53 kansen_02 https://mobile.labmedica.com/microbiology/articles/294766853/genes-and-age-determine-susceptibility -to-lyme-disease.html www.primer.ru www.scidev.net 33 39 leptospira Ještě jednou spirochety www.med.sc.edu:85 34 Možnosti uspořádání bakterií •Jednotlivě •Dvojice •Čtveřice, skupiny po 8 •Shluky •Řetízky •U tyčinek: palisády (||||||), řetízky (-----) diftmik2a Foto O. Z. 35 Tvarové možnosti bakterií • classification http://click4biology.info/c4b/2/cell2.2.htm 36 Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.) 06 ECFS www.morgenwelt.de 37 StreptococcusPyogenes Řetízky v Gramově barvení mikroby.blox.pl 38 Mikroskopie bakterií •Bakterie jsou dobře viditelné v elektronovém mikroskopu, v praxi se nevyužívá •V optickém mikroskopu jsou viditelné mizerně. Lépe je vidíme, pokud se pohybují •Nemůžeme však spoléhat na pohyblivost bakterií. Zviditelníme je proto jinak: fixujeme je a obarvíme některou z barvících metod 39 Části mikroskopu – dopadající světlo •Světlo prochází ze zdroje světla přes kolektor a kondenzor. Kvalitu a množství paprsků ovlivňuje –intenzita napětí zdroje světla –irisová clona kolektoru (v dolní části mikroskopu) –nastavení výšky kondenzoru –nastavení clony kondenzoru (apertura) •Výška kondenzoru se obvykle nastaví při zaclonění. V jednom okamžiku okraj clony přestane být modrý a začne být červený – to je ten správný moment. Pak se clona zase rozevře. 40 olympus_cx31 Mikroskop •Okulár •Objektivy •Mikroskopic. stolek •Kondenzorová clona •Regulátor pozice •Kolektorová clona •Regulátor světla •Mikrošroub a makrošroub Vypínač 41 Zvětšovací optika •V mikrobiologii používáme zpravidla binokulární mikroskop s vyjímatelnými okuláry zvětšujícími 10× •Objektivy se používají 4×, 10×, 20×, 40×, 60× a imerzní objektiv zvětšující 100×. „Imerzní“ znamená, že mezi preparát a objektiv se kápne imerzní olej. Index lomu oleje je bližší indexu lomu skla, než index lomu vzduchu 42 Zaostřování a vlastní mikroskopie •Aniž bychom se dívali do okuláru, přiblížíme makrošroubem preparát k objektivu na co nejtěsnější vzdálenost •Nyní, již pod kontrolou zraku preparát opatrně oddalujeme, nejdříve makrošroubem, pak i mikrošroubem, až se dostaneme na příslušnou hladinu ostrosti •V některých případech (hlavně u nativních preparátů) není jedna hladina ostrosti, ale je nutno stále přeostřovat na „dno“ a „hladinu“ prostoru vyplněného tekutinou 43 Čištění mikroskopu •Po každém použití imerzního oleje je nutno očistit objektiv gázou s alkoholéterem (méně vhodný, leč použitelný, je benzín) •Občas je nutno očistit i neimerzní objektivy, zejména pokud jsou potřísněny např. olejem •Při potřísnění je také nutno otřít mikroskopický stolek, zde stačí čtvereček buničité vaty s benzínem. Nečistota často ulpívá pod zařízením pro uchycení sklíčka 44 Jednoduché barvení •K jednoduchému barvení můžeme použít kde co, například methylenovou modř •V laboratorní praxi se zpravidla nepoužívá, můžeme ho však doporučit např. při telefonické konzultaci vzdálenému klinickému pracovišti •Fixovaný preparát se přelije jedním barvivem, a po zaschnutí se pozoruje 45 Prof. Hans Christian Gram Hans_Christian_Gram Hans Christian Joachim Gram (13. září 1853 – 14. listopadu 1938) byl dánský bakteriolog. Gram studoval botaniku na Kodaňské Univerzitě a byl botanickým asistentem zoologa Japeta Steenstrupa. V roce 1878 začal studovat medicínu a promoval 1883. V roce 1884 v Berlíně vyvinul metodu, která dnes slouží k.rozlišení dvou hlavních tříd bakterií. V.roce 1891 se Gram stal přednášejícím farmakologie, a v témže roce byl jmenován profesorem Kodaňské univerzitě. V roce 1900 převzal vedení farmakologického ústavu. en.wikipedia.org/wiki/Hans_Christian_Gram. 46 Gramovo barvení – princip 1 •Grampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. –Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť… –…a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem… –…se neodbarví ani alkoholem. •Gramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem. 47 Gramovo barvení – princip 2 Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť Obarví se fialově Obarví se fialově Lugolův roztok Vazba se upevní Upevní se méně Alkohol Neodbarví se Odbarví se Safranin Zůstanou fialové Obarví se červeně Gramem se nebarvící bakterie se neobarví v prvním kroku kvůli absenci buněčné stěny (Mycoplasma) nebo proto, že jejich stěna je vysoce hydrofobní (Mycobacterium). Spirochety by se barvily gramnegativně, ale jsou velmi tenké, takže i je lze také vlastně považovat za „Gramem se nebarvící“ a Gram se v jejich diagnostice nepoužívá. 48 Čtyři hlavní skupiny bakterií podle Gramova barvení • 950fb8bfd9ef455198a2d61c04565f85 grampozitivní koky DSCN1675GPTY DSCN1642GNTY gramnegativní tyčinky 49 P1010001 Foto O. Z. 50 Další barvicí metody •Barvení podle Giemsy – spíše na parazity •Barvení dle Ziehl-Neelsena na acidorezistentní bakterie - mykobakteria •Barvení pouzder dle Burriho •Barvení fluorescenčními barvivy mycobacterium tuberculosis ziehl 51 Fluorescenční barvení www.primer.ru DSCN1898 52 Speciální mikroskopické techniky •Mikroskopie v zástinu – používá se u světlolomných objektů (např. spirochet). Na objekt dopadají paprsky zešikma a do oka dopadnou POUZE ty, které se na něm zlomí –Anglicky se jí říká „darkfield microscopy“ – mikroskopie v temném poli. Pozadí je tmavé, bakterie světlá •Mikroskopie ve fázovém kontrastu využívá fázový posun paprsku 53 Zástinová mikroskopie Zástin 54 09 Listeria Nashledanou •Příště budeme pokračovat povídáním o fyziologii bakterií a kultivačních půdách • microbewiki.kenyon.edu